摘要
鸡和鹌鹑为家禽生产中的常见物种，鸡与鹌鹑同种不同属，其间杂交属于禽类中的典型属间远缘杂交，是基因功能研究和比较基因组学的良好资源；而鸡与鹌鹑杂交种在孵化过程中大量死亡，已有研究表明杂交种胚胎的死亡与胚胎组织器官发育不完全和性分化相关，而在胚胎发育、性别分化过程中参与的基因和信号通路众多。本研究对雌、雄鸡和雌、雄杂交种数字基因表达谱进行生物信息学分析筛选出与胚胎发育、性别分化相关基因，构建基因过表达载体和 RNA干扰载体，以鸡胚细胞为实验材料，调控目标基因表达量，利用实时荧光定量技术检测相关基因表达变化，探索目标基因在表达异常时对胚胎发育的影响，为进一步研究雌性杂交种胚胎早期死亡的原因奠定基础。 1.对雌雄鸡与雌雄杂交种 DGE库通过生物信息学分析筛选与胚胎发育、性分化相关显著富集的信号通路，如 MPKA、Hedgehog、Wnt、Notch等；表达差异显著的相关基因 FGF8、DACH、LFNG、SOX1、SOX2、SHH、FOXL2、GPR149、CCND1。 2.差异基因 FGF8、SHH、FOXL2过表达载体和干扰载体的构建，参照 NCBI上公布的原鸡 FGF8、SHH基因 mRNA序列，在基因编码区分别设计扩增全长引物，以 pEGFP-C2为载体，构建鸡 FGF8和 SHH基因过表达载体；经菌液 PCR、酶切鉴定和测序验证，过表达载体构建成功。根据 NCBI上公布的原鸡 FGF8、SHH和 Foxl2基因的 mRNA序列，分别依据基因编码区特点设计3对 shRNA干扰引物，以 pmiRZip为载体，构建靶向 FGF8、SHH、Foxl2基因干扰载体；经测序验证，干扰载体构建成功。 构建成功的 FGF8、SHH过表达载体和 FGF8、SHH、Foxl2干扰载体转染鸡胚细胞，验证表达载体和干扰载体效果。 3.分析 FGF8、SHH、Foxl2基因对胚胎发育的影响，分别将 FGF8、SHH、FOXL2基因表达和干扰载体转染鸡胚细胞，检测相关基因表达，实验结果得出：当 FGF8基因表达量发生变化时，在 MAPK信号通路中，细胞间的链接蛋白 Grb2表达水平降低，进而影响后续一系列信号传递与通路的激活，使胚胎不能正常生长发育。在 Hedgehog信号通路中，干扰 SHH基因的表达时 Hedgehog信号通路不能够被激活而处于抑制状态，使胚胎早期不能够正常发育，当 SHH基因过表达时，能够成功激活 Hedgehog信号通路，并且过度激活，同样对胚胎产生负面影响，例如胚胎出现畸形。干扰 Foxl2基因使其表达量降低，造成胚胎发育早期参与性别分化的 DMRT1、SOX9、CYP19基因表达发生紊乱，而导致在发育性分化过程中出现异常，使胚胎不能正常生长发育。
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