摘要
在我国，中药从古至今被广泛地使用着。现今，随着世界范围内对于天然产物的认知程度提升，越来越多的国家和地区开始关注和使用中药。三七（Panaxnotoginseng）是一味名贵药材，中医认为其具有散瘀止血，消肿定痛之功效。现代药理学研究证实三七具有许多非常重要的生物活性，包括血管舒张、降血脂、抗氧化以及抗肿瘤的作用。进一步的研究发现，三七的药理作用主要来自于其主要的成分人参皂苷。三七中的人参皂苷主要包括人参皂苷以及三七皂苷。根据结构不同，可以分为原二醇型人参皂苷[20(S)-protopanaxadiol type(ppd-type)ginsenosides]以及原三醇型人参皂苷[20(S)-protopanaxatriol type(ppt-type)ginsenosides]。其中，含量较高的二醇型人参皂苷为Rb1，Ra3，Rd和Rc，含量较高的三醇型为Rg1， Re和三七皂苷R1。此外，很多其它的人参属植物如亚洲人参和西洋参，它们的主要药理活性也是来源于它们所含的人参皂苷类成分。然而有研究报道称不同的人参皂苷有不同的甚至是截然相反的药理学活性，导致三七等作为整体给药时候的药理作用不明确。由于药物的疗效与其活性成分的机体暴露水平息息相关，因此对于三七给药以后机体的人参皂苷系统暴露水平及其变化特征的研究是非常有必要的。 组内前期研究工作表明，虽然二醇型和三醇型人参皂苷的化学结构非常相似，具有一样的四环三萜达玛烷型的母核结构，但是人和大鼠在三七提取物给药以后两类人参皂苷的系统暴露水平是显著不同的。大鼠口服给予三七提取物以后，由于生物利用度差以及快速且大量的胆汁排泄使得大多数的三醇型人参皂苷的系统暴露水平很低且消除半衰期非常短。虽然二醇型人参皂苷的口服生物利用度也很低，甚至低于部分三醇型人参皂苷，但是其非常缓慢的胆汁和肾排泄弥补了吸收不足，造成了其较高的系统暴露水平以及较长的消除半衰期。同样的，静脉给药二醇型和三醇型人参皂苷纯品时，情况和口服给药一致，二醇型人参皂苷的系统暴露水平远高于三醇型人参皂苷。二醇型人参皂苷因其具有良好的PK属性而被认为是三七提取物给药以后的PK-markers。因此，围绕着二醇型和三醇型系统暴露水平差异的机理研究及进一步的系统暴露调控因素和暴露调控环节上所产生的药物相互作用可能性研究，有助于更深入地明确三七的药效物质基础，明确临床使用的有效性和安全性，并对于指导以人参皂苷为主要活性成分的中药临床合理用药有着重要的意义。 在本论文研究中，我们选取了大量且快速胆汁排泄的人参皂苷Rg1，Re以及三七皂苷R1作为三醇型人参皂苷的代表化合物，选取人参皂苷Rb1，Rc和Rd作为二醇型的代表化合物，开展了人参皂苷与人及大鼠的肝脏转运体亲和性研究。为此，我们建立了摄取转运体鉴定的HEK293瞬时表达肝脏转运体的细胞模型并购买了表达有外排转运体的膜囊用于体外研究。实验结果表明:三醇型人参皂苷Rg1，Re以及三七皂苷R1是人肝脏摄取转运体OATP1B3很好的底物而不是人肝脏转运体OATP1B1以及OATP2B1的底物。OATP1B3对人参皂苷Rg1，Re以及三七皂苷R1的亲和常数Km，最大转运速度Vmax以及内在清除率CLint值分别为14-73μM，12-22 pmol·min-1 per mg protein以及0.2-1.5μL· min-1 per mg protein。此外，外排转运体研究结果显示这些三醇型人参皂苷是多类外排转运体的底物，包括MDR1，MRP2，BCRP以及BSEP。相关的动力学参数分别为Km值分别为89-108，175-221，31-106，10-43μM; Vmax值为40-191,24-38,17-26,4-113 pmol·min-1 per mg protein; CLint值为0.4-2.0,0.1-0.2，0.2-0.5，0.4-2.6μL· min-1 per mg protein。而相反地，二醇型人参皂苷既不是摄取转运体OATPs的底物，也不是任何外排转运体的底物。结合二醇型人参皂苷差的膜通透性（Papp值为1.5-4.3×10-7 cm· s-1），我们认为二醇型人参皂苷的胆汁排泄过程主要是缓慢的被动扩散过程，而三醇型的人参皂苷因为是肝脏摄取及外排转运体的底物，通过转运体介导完成快速胆汁排泄过程。这就解释了二醇型和三醇型胆汁排泄水平差异的原因。此外，大鼠的转运体鉴定数据显示了和人类似的实验结果。大鼠肝脏摄取转运体Oatp1b2以及外排转运体Mrp2，Bcrp，Bsep介导了三醇型人参皂苷快速胆汁排泄过程。为了进一步研究胆汁排泄对于人参皂苷系统暴露以及机体处置的影响，我们分别采用利福平（Oatps抑制剂）化学敲除法以及Mrp2先天性功能缺失的EHBR大鼠模型来考察摄取及外排转运体功能异常时，三醇型人参皂苷胆汁排泄水平的变化以及继而导致的系统暴露水平及组织分布的变化。实验结果表明，无论是摄取转运体还是外排转运体功能异常时均会导致三醇型人参皂苷的胆汁排泄水平显著下降。虽然由此造成的系统暴露水平较正常组有显著的增加（2-4倍），但仍然远远低于二醇型人参皂苷的系统暴露水平。我们发现，造成二醇型和三醇型人参皂苷系统暴露水平差异的原因除了胆汁排泄的分子机理不同以外，二者的肾排泄水平也具有显著的差异。前者的大鼠及人血浆蛋白结合率高达99.1％-99.9％，而后者的血浆蛋白结合率仅为23％-38％。二醇型极高的血浆蛋白结合率限制了游离分数依赖的肾小球滤过，进而限制了二醇型的肾排泄过程。三醇型人参皂苷游离分数较低，使得肾小球滤过较为迅速，当胆汁排泄过程被抑制时，肾排泄过程能够迅速代偿，减少胆汁排泄抑制对系统暴露水平以及消除半衰期的影响。因此，我们认为结构上非常类似的二醇型和三醇型人参皂苷系统暴露水平差异的分子机制在于两类人参皂苷对肝脏转运体以及血浆蛋白的亲和性的不同，导致了转运体介导的胆汁排泄水平以及血浆蛋白结合相关的肾排泄水平的巨大差异。 此外，我们还从victim（其它药物对人参皂苷的影响）和perpetrator（人参皂苷影响其它药物）两个角度对肝脏转运体介导的与人参皂苷相关的药物-药物相互作用进行了评估。大鼠静脉给予Oatp1 b2的抑制剂利福平以后，虽然三醇型人参皂苷的胆汁排泄水平降低至对照组的3％-11％，但肾清除率CLR保持不变。因此，基于肾排泄的代偿作用，三醇型的系统暴露水平变化程度有限。另外，通过对比日本普通SD大鼠和日本EHBR大鼠人参皂苷Rg1组织分布实验结果可以看出，Mrp2的功能缺失使得人参皂苷Rg1的肝脏暴露水平略微增加（约1.4倍），而预期的肝脏Cmaxx增加并没有出现，相反Cmax降低至对照组的48％。推测原因一方面由于先天性Mrp2缺失导致了在基底膜侧表达的Mrp1代偿性上调，Mrp1能将人参皂苷Rg1从肝脏中泵回至循环系统中，部分抵消了由Mrp2造成肝脏暴露水平增加的程度。另一方面，人参皂苷Rg1的胆汁外排是多泵体系参与，Mrp2的功能缺失可由其它外排转运体部分代偿。除了人参皂苷Rg1之外，其他的三醇型人参皂苷的肝细胞外排过程也是多个转运体介导的，由此我们认为外排转运体水平上的药物-药物相互作用不易造成三醇型人参皂苷肝细胞蓄积，引发肝细胞毒性。因此，我们推测无论是由于药物-药物相互作用或疾病状态下转运体功能缺失的情况下，人参皂苷的系统暴露水平以及肝中浓度不易出现具有临床意义的急剧增加。非常值得注意的结果是，虽然二醇型的人参皂苷Rb1，Rc，Rd不是OATP1B转运体的底物，但是却能够对OATP1B介导的阳性底物转运作用产生显著的抑制。其中，对OATP1B1介导的阳性底物E217βG的转运过程半数抑制浓度IC50值为1-5μM，而对OATP1B3介导的的阳性底物E217βG的转运过程IC50值仅为0.2-0.5μM。作为OATP1B3底物的三醇型人参皂苷Rg1，Re和三七皂苷R1对OATP1Bs的抑制作用不如二醇型显著，IC50值分别为70-359μM（OATP1B1）和39-332μM(OATP1B3)。考虑到口服人参皂苷生物利用度差导致体内所能达到的浓度有限，我们认为中低剂量的人参皂苷口服给药时候不太容易引起OATP1Bs抑制造成的药物相互作用。但是结合本实验室正在进行的临床实验数据以及文献报道的含人参皂苷注射液的人体数据计算可以得出，二醇型的人参皂苷Rb1造成OATP1B1和OATP1B3抑制的药物-药物相互作用指数(DDI index)分别为0.05-0.18和0.54-1.77。美国FDA关于药物相互作用指导原则中指出当DDI指数大于0.1时，提示有产生有临床意义药物相互作用的风险。而在外排转运体方面，由于二醇型人参皂苷对外排转运体基本无抑制作用，而三醇型转运体的半数抑制浓度均在100μM以上。结合三醇型人参皂苷在肝中极短的半衰期，我们认为，人参皂苷不会在肝脏外排转运体水平影响其他药物的胆汁排泄过程。由于含人参皂苷注射液在心血管疾病的治疗被广泛大量的使用，注射液给药后人体的人参皂苷的浓度能达到很高的水平，且二醇型人参皂苷的长半衰期提示着机体浓度蓄积的风险，结合临床中很多重要的治疗心血管疾病药物如替米沙坦以及大多数的他汀类降血脂药物均是OATP1B1或OATP1B3的底物，他们和人参皂苷注射液以及高剂量的含人参皂苷提取物如三七提取物合用时的药物-药物相互作用风险需要引起重视。
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