摘要
威兰胶是一种微生物多糖，具有独特的流变学性质和良好的耐高温、耐酸碱特性，广泛应用于工农业的各个方面。目前威兰胶工业生产采用鞘鞍醇单胞菌，发酵温度30℃，为维持这一温度，发酵过程需要大量冷却水冷却，超过30℃，生产成本较高，威兰胶合成严重下降甚至停产。另外，在中国炎热的夏季冷却水已难以使发酵温度控制在30℃，生产企业经常季度性停产。提高威兰胶生产菌株耐温性是解决以上问题的根本。但至今未见耐温型威兰胶生产菌株的研究报道。本论文以Sphingomonas sp.NX-3菌株为研究对象，采用诱变育种和分子生物学手段，选育得到在37℃甚至更高温度下威兰胶高产菌株，提高了菌株耐温性，通过分析菌株耐温机制，发现热休克蛋白Clp底物入口氨基酸突变减小了空间位阻，利于底物进入Clp活性中心，热休克蛋白DnaJ二聚体结合域氨基酸突变利于二聚体高温下结构稳定，最终促进了高温下菌株存活和合成威兰胶。本论文主要研究工作如下: 1、采用ARTP技术诱变Sphingomonas sp.NX-3菌株，成功筛选到高产威兰胶温度耐受型新菌株HT-1。突变株在30℃下和37℃均生长良好，在37℃下7.5 L发酵罐威兰胶浓度达到26.8±0.34 g/L，300 L发酵罐威兰胶浓度达到27.5 g/L的高水平。 2、研究了高产威兰胶温度耐受型HT-1菌株的生理机制。细胞膜饱和脂肪酸比例增大、内外膜通透性增高、细胞膜比表面积增大，有助胞外底物的转运与胞内产物的分泌，利于HT-1在37℃下威兰胶高效合成:抗氧化酶SOD、CAT、POD活性分别提高了1.36、1.31、0.79倍，减少MDA含量34.7％，降低了膜脂质过氧化水平，热休克蛋白DnaJ、Clp基因表达水平显著提高3.54和3.61倍，利于HT-1菌株37℃下体内蛋白质维持稳定构象，从而维持细胞正常生理功能。 3、通过分子理性设计强化改造了威兰胶合成菌株温度耐受能力。通过对比分析发现突变株HT-1热休克蛋白ClpH氨基酸残基Asp74Ala和Asn75Gly发生突变，DnaJH氨基酸残基Met8Val和Ser12Phe发生突变;单一表达ClpH或DnaJH不能显著提高菌株耐受温度，共表达ClpH和DnaJH使菌株耐受温度提高了5℃，且重组菌在37℃、40℃、42℃下均可正常生长，稳定合成26.9±0.29 g/L威兰胶，满足威兰胶工业化生产要求;另外共表达重组菌DHCH具有酸碱抗逆性，可以帮助威兰胶发酵过程维持稳定。 4、解析了ClpH和DnaJH促进高温下菌株高效生长代谢机制。通过纯化获得均一高纯度ClpH、DnaJH与CIpN、DnaJN蛋白，ClpH使柠檬酸合成酶复性效率明显提高95％，DnaJH使柠檬酸合成酶复性效率明显提高74％，两者活性均显著高于ClpN与DnaJN;通过同源建模获得Clp蛋白结构，推测ClpH高效生物学机制为:ClpH蛋白位于六聚体结构中底物进口的Ala氨基酸和Gly氨基酸，相比ClpN的Asp、Asn，有效减小进口的空间位阻，利于底物蛋白进入Clp蛋白腔内完成去折叠;通过晶体培养与模拟搭建获得DnaJ蛋白结构，推测DnaJH高效生物学机制为:DnaJH蛋白位于二聚体结构中聚合体结合区域的Val氨基酸和Phe氨基酸，相比DnaJN的Met、Ser，Phe上携带苯环使得二聚体结构不易解散，最终促进了高温下菌株的高效生长代谢。 5、添加正十六烷提高威兰胶合成菌株抗氧化酶活性，从而有效强化威兰胶生物合成。SOD、CAT、POD活性分别为不添加烷烃的2.50、2.52和2.41倍，威兰胶生成浓度最高达到了33.9±0.64 g/L，葡萄糖转化率达到0.761±0.015 g/g;威兰胶前体合成关键基因pgm上调4.5倍，ugp上调3.3倍，能量代谢系统关键基因icd上调2.1倍，mdh上调2.9倍，bd上调2.9倍，最终促进了威兰胶高效合成。
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