摘要
目的： 本研究首先对经过传统高温水煎方法得到的甘草浸膏中是否含有miRNA进行鉴定，然后通过高通量测序进行进一步的验证，以证明甘草中是否存在稳定性很高的miRNA，同时也表明其中是否含有丰富的miRNA。如果确认得到甘草miRNA，则将其作用于从健康人外周血中分离出的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC），从细胞形态学的变化，细胞计数鉴定细胞的增殖情况，流式检测细胞表型变化，免疫相关基因表达等几方面，初步探究甘草miRNA对免疫细胞的影响。 方法： 一、对甘草的水煎剂经过高温处理后又经高温蒸煮和冷冻干燥处理，通过通用植物microRNA快速提取试剂盒进行小分子RNAD提取，然后电泳检测是否提取到甘草miRNA，经过DnaseⅠ消化后，对其浓度和纯度进行检测。 二、利用HiSeq高通量测序技术，对甘草miRNA进行测序分析，并预测其中是否存在新的miRNA。即原始数据统计处理后得到的干净Clean序列进行比对、碱基偏向性分析和小RNA分类注释后，再将没能比对上又没有注释到数据库中的小RNA进行新miRNA的预测。 三、将所得到的甘草miRNA靶向人类基因进行比对分析，初步筛选得到甘草miRNA调控的候选人类靶基因，并运用GO分析对这些靶基因的功能进行分类和注释。 四、利用所提取的甘草miRNA作用于从健康人外周血中分离出的外周血单核细胞，细胞形态学观察和计数后，流式检测细胞表型的变化。利用RT-PCR对部分细胞因子、信号分子和转录因子的表达变化进行分析，初步探索甘草miRNA对人免疫细胞的影响。 结果： 一、经过炮制的甘草干燥药材，经过高温熬煮，所得水提物又经高温蒸煮和冷冻干燥，从得到的甘草浸膏冻干物中有效地提取到了miRNA，表明植物miRNA的结构非常稳定不易被破坏，同时也为中药miRNA能够经消化道进入人体提供了佐证。 二、对得到的甘草miRNA的测序，根据测序结果分析其中得到已知的miRNA并预测新的miRNA。测序结果中有个重要的发现就是，干净序列(clean序列)经比对分析发现甘草中含有310个miRNA家族。这在目前的miRNA的研究领域是不常见的，因为模式生物拟南芥也仅发现529个miRNA家族。另一个发现是预测到7个新miRNA。 三、经过靶基因预测，发现甘草中的部分miRNA对人类基因高度匹配。如MIR155、MIR5303、MIR8016这三个miRNA分别与IL-6、STAT1、BCL-2相匹配。被预测到的靶基因中与免疫系统相关基因数量庞大，将近1100个左右。这些结果从一定程度说明甘草miRNA可能对人的免疫功能有影响。这使得在理论上miRNA进行跨物种调控成为一种可能。 四、甘草miRNA不仅能够增强PBMC的增殖能力，还能够增强免疫细胞的抗原提呈能力，流式分析表明，经过miRNA处理的PBMC中HLA-DR+细胞发生了非常显著的增殖，而HLA-DR+细胞的增加意味着抗原提成能力的增强。这可能部分解释了甘草miRNA具有调节机体免疫功能的作用。RT-PC结果表明，甘草miRNA对信号分子和转录因子的表达引起明显的变化，而信号分子和转录因子表达的变化会引起信号通路的激活或被抑制。这可能能够进一步解释其具有免疫调节功能。 结论： 甘草干燥药材水提物中miRNA的存在，以及甘草miRNA对人免疫细胞的调节作用的发现，为我们提供了认识和研究甘草的一个新途径。进一步研究其miRNA的功用，将对甘草的作用机制研究和临床应用乃至甘草的剂型开发和新药研制带来新的思路。
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