摘要
琥珀酸是重要的C4平台化合物，以生物法制备琥珀酸因具有能耗低、环境友好及固定二氧化碳等优势而备受关注。 在生物法生产琥珀酸的过程中除琥珀酸外还有乙酸、丙酮酸等有机酸产生，需要添加碱将发酵过程的pH值控制在近中性以维持微生物细胞的正常生长及代谢，这就导致发酵液中的琥珀酸大多以琥珀酸盐的形式存在。为了获得琥珀酸产品，需要在分离纯化阶段添加大量的酸进行酸化，不仅提高了分离的成本，也产生了大量的高盐废水。目前解决这一问题的最有效方法是降低发酵过程的pH值，提高生产菌的耐酸性能，减少碱的添加量，以使发酵产物更多地以游离琥珀酸的形式存在。 GAD系统是大肠杆菌体内最强的耐酸系统，由谷氨酸脱羧酶(GadA/B)和谷氨酸:γ-氨基丁酸(GABA)逆向转运子(GadC)组成。EvgA/S是一种典型的双组份信号转导系统，作为转录因子的EvgA能够间接促进基因gadBC的表达。本论文以E.coli AFP111为研究对象，利用分子生物学手段构建了单表达gadBC和evgA基因，或共表达两个基因的重组菌株，并考察了不同重组菌在酸性胁迫下的生长及代谢性能，最终获得了可在酸性胁迫环境中高效合成琥珀酸的生产菌株。 主要方法和结果如下: 首先，利用分子克隆手段，采用目的基因自身的表达元件，将gadBC与evgA两个基因分别连接到克隆质粒pMD19-T与pUC18上，获得重组质粒pMD19-T-gadBC与pUC18-evgA，进一步地，将evgA基因连接到pMD19-T-gadBC重组质粒上获得了质粒pMD19-T-gadBC-evgA，将重组质粒导入AFP111中，构建三株重组菌分别命名为BA601(AFP111/pMD19-T-gadBC)、BA602(AFP111/pUC18-evgA)、BA603(AFP111/pMD19-T-gadBC-evgA)。 考察了重组菌在平板上对对酸性冲击的耐受性能。以出发菌AFP111为对照，在pH值分别为4.6、5.0、5.6的LB平板上涂布200μL由试管中培养过夜的并经ddH2O稀释至OD600=4×10-4的菌液，在37℃条件下培养12小时。实验结果表明，在pH5.6的平板培养基上，各重组菌的菌落密集分布，而AFP111的菌落则较稀疏;在pH5.0的平板上，各重组菌的单菌落数明显减少，但仍比AFP111的菌落数多;在pH4.6的平板上，各重组菌只有少量单菌落分布，而AFP111的平板上几乎没有菌落。在相同pH值的平板上，BA601和BA603的菌落数均比BA602的多。表明耐酸元件在AFP111中得到了很好的表达，使重组菌具有更强的耐酸能力，但是单独表达EvgA时的耐酸能力相对较弱。 考察了重组菌在酸性条件下的生长性能。以出发菌AFP111为对照测定各重组菌在pH4.6、5.0、5.6时的生长曲线。结果显示，同一菌株的最大DCW随着pH值的降低而减小，但pH相同值条件下各重组菌与AFP111的最大DCW均相差不大，但重组菌达到最大DCW的时间明显减少。这进一步证明了含有耐酸元件即功能蛋白GadBC和调控蛋白EvgA的AFP111菌株在pH5.0与pH5.6时的生长性能均优于pH4.6时。此外，在相同pH条件下，三株重组菌的生长曲线无明显差异。 比较了出发菌与三株重组菌在酸性条件下发酵性能。在3-L发酵罐中进行有氧-厌氧两阶段发酵时，将有氧阶段pH值控制在6.8，厌氧阶段pH值控制在5.6。结果显示，在四个菌株中，BA601具有最佳的产琥珀酸性能。琥珀酸最终积累浓度为26.58 g/L，生产速率为0.51 g/L·h，分别比出发菌AFP111提高了1.18倍和0.67倍。 进一步考察了出发菌株AFP111和重组菌BA601在更低pH条件下的发酵性能，仍然把有氧阶段pH值维持在6.8，厌氧阶段pH值则维持在5.0，分别将AFP111与BA601在3-L发酵罐中进行发酵。结果显示，AFP111最终耗糖量仅为7.00 g/L，琥珀酸产量为4.02 g/L，生产速率分别为0.11 g/L·h。但BA601最终消耗17.00 g/L葡萄糖产生15.04g/L琥珀酸，生产速率为0.27 g/L·h，比AFP111分别提高了1.45倍。 考虑到GAD系统在pH5.6条件下活性最高，因此进一步考察了重组菌BA601有氧与厌氧阶段均维持pH5.6的两阶段发酵性能。结果显示，有氧生长阶段DCW达到12.00g/L的时间与pH6.8时相比无大差别。转入厌氧阶段后，经过48小时后琥珀酸浓度为17.18g/L，生产速率0.36 g/L·h。与单独把厌氧阶段控制在pH5.6相比，琥珀酸浓度和生产速率分别降低了0.35和0.03倍。其可能原因是有氧培养过程中较低的pH降低了细胞的活性，尤其是与琥珀酸积累相关的酶的活性下降，降低了细胞的的产琥珀酸性能。
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