摘要
随着人们健康和环保意识的不断提高，生物防治作为一种安全、环保、长效的防治手段逐渐被人们所接受。很多研究证实拮抗酵母菌对果蔬采后病害具有良好的抑制效果，利用拮抗酵母菌减少化学杀菌剂的使用有巨大的应用前景。但拮抗酵母菌的商业化生产成了现阶段生防研究领域的一个瓶颈问题，目前市场上仅有极少数商业化生防菌出售。为了能廉价、高效地生产拮抗酵母菌生防制剂，本文利用甘蔗糖蜜作为发酵原料，对糖蜜培养基的优化进行了较为全面的探讨，并对其发酵条件和真空冷冻干燥条件进行了初步研究。主要研究结果如下: 1.采用煮沸法、磷酸法、硫酸法、活性炭法、亚铁氰化钾法对糖蜜进行预处理，比较不同方法对拮抗酵母菌生长的影响，结果表明酸处理法优于其他处理方法;与磷酸处理相比，硫酸预处理后的糖蜜配制的培养基中拮抗酵母菌生长效果最好。 2.通过单因素试验研究了糖蜜浓度、氮源及浓度、初始pH值、磷酸盐、硫酸镁、氯化钠等培养基组分对拮抗酵母菌生长的影响;采用Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验和中心组合试验设计对培养基组分进行优化，得到优化培养基组分。葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum):预处理后糖蜜78.9 g·L-1，酵母粉2.2 g·L-1，初始pH值6.0;季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii):预处理后糖蜜75.1 g·L-1，酵母粉2.5 g·L-1，初始pH值5.9;复合拮抗酵母菌:预处理后糖蜜78.0 g·L-1，酵母粉2.7 g·L-1;尿素0.03 g·L-1，初始pH值7.0。通过验证试验获知与PDB培养基相比，优化后糖蜜培养基使H uvarum、P.guilliermondii及两者的复合酵母菌生物量分别提高了1.8倍，2.2倍，1.9倍。 3.通过对拮抗酵母菌摇瓶和10 L发酵罐发酵条件的初步研究，确定摇瓶发酵条件H uvarum为:接种量3％,装液量50 mL，摇床转速180 r·min-1;P.guilliermondii为:接种量2％,装液量50 mL，摇床转速180 r·min-1;两者复合菌为:接种量5％,装液量50 mL，摇床转速180 r·min-1。10L发酵罐分批发酵过程特征曲线表明两种拮抗酵母菌均能够利用甘蔗糖蜜进行发酵，并在24 h的生产周期内，细胞浓度均可达到1×1010 CFU·mL-1以上，具有扩大化生产的可行性;同时对这两种拮抗酵母菌来讲，当发酵液的残糖量低于3.0 g·L-1，pH值低于4.0左右时，培养液的活菌浓度不再增加，因此，在后续拮抗酵母菌连续培养时可通过补糖补碱等措施控制培养液的pH值不低于4.0，残糖量不低于3.0 g·L-1。 4.采用真空冷冻干燥法初步研究了制备拮抗酵母活性干粉的条件，通过单因素和复配试验确定H.uvarum最佳保护剂配方为:10％蔗糖+10％脱脂奶粉，冻干存活率可达86.0％;P.guilliermondii最佳保护剂配方为:5％蔗糖+5％脱脂奶粉，冻干存活率可达81.6％;两者的复合菌最佳保护剂配方为:10％蔗糖+15％脱脂奶粉，冻干存活率可以达到89.9％。通过贮藏试验发现低温贮藏3个月后酵母干粉活性下降不显著，其活菌浓度在1×1012 CFU·g-1以上，干粉活性保存效果较好。说明低温较常温更适于拮抗酵母干粉的储存。
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