三种常见蜜蜂病毒环介导等温扩增方法的建立

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中文摘要：蜜蜂是重要的授粉昆虫，对整个自然生态系统有着不可取代的作用。蜜蜂黑蜂王台病毒（black queen cell virus,BQCV）、蜜蜂残翅病病毒（deformed wing virus,DWV）、蜜蜂囊状幼虫病毒（sacbrood virus,SBV）是常见并且对蜜蜂危害严重的蜜蜂病毒。常用的检测方法有分子生物学、症状、免疫学等。但这些方法在仪器、技术等方面有特别的要求，实用性不强。因此针对BQCV、DWV、SBV建立一种快速、敏感性高、特异性强、无需专用设备的实用性检测方法是有必要的。环介导等温扩增技(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)在等温条件下，仅需要一个水浴锅在1 h内就可完成反应，通过荧光染料即可观察结果，具有快捷、简便的特点。本研究建立并优化了BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP，验证特异性并与常规PCR技术对比验证敏感性，并分析其与PCR检测临床样本的差异。主要研究结果： 1）建立并优化了BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP，优化后的BQCV-LAMP体系外、内引物比为1:3，甜菜碱浓度为0.8 mmol/L，Mg2+浓度为2.0 mmol/L，在63℃条件下反应45 min；SBV-LAMP体系外、内引物比为1:2，甜菜碱浓度为0.6 mmol/L，Mg2+浓度为2.0 mmol/L，在63℃条件下反应45 min；DWV-LAMP体系外、内引物比为1:4，甜菜碱浓度为0.6 mmol/L，Mg2+浓度为2.0 mmol/L，在63℃条件下反应60 min。 2）BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP均只有对BQCV、DWV、SBV出现多梯形条带，特异性好。BQCV-LAMP的灵敏度可达86 fg的RNA模板，常规PCR8.6 pg的RNA模板，说明BQCV-LAMP的灵敏度比BQCV-PCR的要高100倍；SBV-LAMP的灵敏度可达93 fg的RNA模板，常规PCR0.93 pg的RNA模板，说明SBV-LAMP的灵敏度比SBV-PCR的要高10倍；DWV-LAMP的灵敏度可达8.9 fg的RNA模板，常规PCR8.9 pg的RNA模板，说明DWV-LAMP的灵敏度比DWV-PCR的要高100倍。 3）临床检测：用BQCV-LAMP方法检测中华蜜蜂和意大利蜜蜂样本各20份，其中阳性数量分别为5和15，阳性检测率分别为25%和75%；PCR方法检测同样中华蜜蜂和意大利蜜蜂样本，阳性数量分别为3和11，阳性检测率分别为15%和55%。SBV-LAMP方法检测20份中华蜜蜂样本，阳性数量分别为12，阳性检测率分别为60%；PCR检测同样20份中华蜜蜂样本，阳性数量分别为9，阳性检测率分别为45%。DWV-LAMP方法检测20份意大利蜜蜂样本，阳性数量分别为11，阳性检测率分别为55%；DWV-PCR方法检测同样20份意大利蜜蜂样本，阳性数量分别为7，阳性检测率分别为35%。BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP三种检测方法均比相应的常规PCR方法检测率高。

作者：

庄明亮

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关键词：

黑蜂王台病毒囊状幼虫病毒残翅病毒环介导等温扩增 PCR检测

授予学位：

硕士

学科专业：

畜牧学

导师：

梁勤

学位年度：

2015

学位授予单位：

福建农林大学

语种：

中文

中图分类号：