摘要
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)能代谢产生多种抗菌活性物质，具有抗细菌、真菌、病毒的功能，能够防治多种植物病害。其中，LI-F类抗菌脂肽是一种天然的广谱抗菌物质，由于其具有安全、稳定等优点，在食品、医药和农业等领域应用潜力巨大。然而，野生型菌种的产量很低，使生产成本增加，导致LI-F类脂肽不能大规模生产，从而限制了其工业化应用。 本研究以多粘类芽孢杆菌JSa-9为出发菌株，采用多种选育方式提高其产LI-F类抗菌脂肽的能力，以期得到性质稳定的高产菌株，为今后其工业化生产应用奠定基础。主要研究成果如下: 1.采用制备液相方法对多粘类芽孢杆菌发酵产LI-F抗菌脂肽建立定量标准检测方法。通过制备液相色谱得到脂肽LI-F的纯品，纯度在93％以上。脂肽LI-F检测标准曲线方程为:y=3401x-280.9，其线性相关系数达到0.9991，通过计算得知多粘类芽孢杆菌JSa-9发酵液中LI-F类抗菌脂肽的产量为88.19mg/L。 2.通过物理和化学方法对多粘类芽孢杆菌JSa-9诱变选育，获得高产LI-F类抗菌脂肽的营养缺陷型菌株。分别采用亚硝基胍、60Co-γ射线和低能氮离子束注入三种诱变方法对其进行诱变处理，通过致死率和正突变率统计，确定NTG最佳诱变浓度为50μg/mL;60Co-γ射线的最优辐照剂量为200Gy;低能氮离子束最佳注入剂量为20keV，注入时间30s。经过点植对照法和生长谱法筛选鉴定，得到了两株营养缺陷型菌株N1-37和N2-27，分别为苯丙氨酸缺陷型和组氨酸缺陷型。与野生菌株相比，N1-37和N2-27菌株的发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性分别提高了45.54％和32.35％，对串珠镰孢菌的抑菌活性分别提高了23.12％和21.85％，对尖镰孢菌的抑菌活性分别提高了18.08％和15.59％。N1-37和N2-27的脂肽LI-F产量分别是野生菌JSa-9的1.71倍和1.4倍。 3.对营养缺陷型菌株N1-37和N2-27进行原生质体融合技术研究。制备原生质体的最佳条件为:对数期种子液经过二次转接后培养8h收集菌体;溶菌酶浓度为0.1mg/mL;酶解温度37℃;酶解时间7min;酶解后原生质体形成率均达到了97％以上，再生率均大于30％。PEG6000诱导原生质体融合的最佳条件:PEG6000浓度为40％，pH值为9.0，融合时间为15 min。经过筛选获得一株高产融合子F5-15。通过测定其发酵液其中对金黄色葡萄球菌的抑菌活性提高了84.70％，对串珠镰孢菌抑菌活性提高了49.32％，对尖镰孢菌的抑菌活性提高了38.96％。产LI-F类抗菌脂肽的产量为野生菌的3.1倍。 4.以原始菌株JSa-9为对照，采用实时荧光定量PCR的方法对融合子F5-15的LI-F类抗菌脂肽合成酶基因fus A1、fus A2、fusC1和fus C2的表达进行分析。首先采用Trizol法提取得到RNA，测定其R值为1.93，说明所提RNA纯度较高。之后进行反转录合成cDNA，以其为模板，以16S rDNA作为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测，结果表明，各基因表达量分别是是原始菌株表达量的10.48倍、2.48倍、2.1倍和11.8倍。
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