摘要
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由革兰氏阳性细菌合成的天然聚合物，可以广泛应用于医药、食品、化妆品、农业及水处理领域，具有水溶性好、可生物降解、可食用等优点，并且对人类和环境无毒。γ-PGA具有广阔的应用前景，但目前国内还没有真正实现γ-PGA的产业化，因此有必要通过合理的调控策略强化γ-PGA合成，降低生产成本，以达到γ-PGA大规模生产的目的。 本论文以一株γ-PGA生产菌Bacillus subtilis NX-2为研究对象，针对γ-PGA生物发酵过程中出现的溶氧传质差、氧气利用率低等问题提出了一系列工程手段和策略强化γ-PGA合成，并分析了γ-PGA生物合成关键酶基因的功能，最终实现了低成本、高效率的γ-PGA产业化生产。本论文主要研究工作如下: 1、建立了B.subtilis NX-2的电子呼吸链模型，该模型主要由NADH脱氢酶，琥珀酸脱氢酶，细胞色素bc1复合体及终端氧化酶构成。通过调控搅拌转速考察了不同溶氧水平对B.subtilis NX-2发酵生产γ-PGA过程的影响，结果显示转速过高或过低都不利于γ-PGA合成，在600 r/min时γ-PGA的产量达到最高值34.4±0.71 g/L。利用RT-PCR技术分析不同搅拌转速条件下电子传递末端氧化酶基因与γ-PGA合成相关酶基因的转录水平差异，分析结果表明细胞色素bd氧化酶基因（cydA）在低溶氧条件下表达量最高;γ-PGA合成酶基因(pgsB)的转录水平随着搅拌转速的增加而增强;但过高的搅拌转速会导致γ-谷氨酰转肽酶基因（ggt）的表达增强，不利于产物γ-PGA的积累。因此分析比较了400和600 r/min两个搅拌转速条件下的动力学参数，提出了一种两步搅拌转速控制策略，即0-24 h转速调控为600 r/min，24-72 h转速调控为400 r/min，使得γ-PGA产量达到40.5±0.91 g/L，生产强度达到0.56±0.012 g/L/h。采用该策略不仅提高了外源谷氨酸的消耗速率，也提高了异柠檬酸脱氢酶的活性，从而增加了该节点通向谷氨酸的代谢流量，最终达到促进γ-PGA合成的目的。 2、为了降低机械搅拌能耗，同时提高培养基的溶氧能力，将氧载体引入γ-PGA的发酵生产过程。在400 r/min条件下，添加正己烷，正庚烷和正十六烷均能有效提高γ-PGA的产率和分子量。在添加0.3％正庚烷时γ-PGA产率提高至39.4±0.19 g/L，分子量达到(19.0±0.02)×105 Da。对上述三种氧载体对γ-PGA合成的协同作用进行了研究，在三者最佳的协同浓度下，即添加正己烷0.240％，正庚烷0.407％，正十六烷1.014％时，γ-PGA最高产率达到41.5 g/L。进一步研究了正十二烷对γ-PGA合成及分子量的影响。添加正十二烷时γ-PGA的分子量由对照的(14.9±0.04)×105 Da降至8.4±0.02×105 Da，最终产量降至20.1 g/L±0.10 g/L，但极大地促进了菌体生长，最高菌体干重高达6.95±0.14 g/L。对其发酵机理进行分析，发现添加正十二烷时由于发酵液粘度的下降使得发酵体系容积传质系数(kLa)和溶氧浓度(DO)提高，而胞内NADH/NAD+比值和ATP浓度大大降低，进一步导致流向TCA循环的代谢流量减少，最终造成了γ-PGA产量的降低。RT-PCR结果分析显示，添加正十二烷时电子传递末端氧化酶基因和TCA循环相关酶基因的表达受到抑制，使得γ-PGA产量下降;而ggt基因的转录水平的增加则是导致γ-PGA分子量降低的主要原因。 3、为进一步提高B.subtilis NX-2在发酵生产γ-PGA过程中对氧气的利用能力，降低原料成本，将透明颤菌血红蛋白(VHb)在B.subtilis NX-2中进行表达。首先对传统的Spizizen转化方法进行改进，实验结果显示在添加4％吐温-80时B.subtilis NX-2的转化效率最高。通过重叠PCR方法将P43强启动子与透明颤菌血红蛋白基因(vgb)连接，构建至表达载体pMA5，获得重组载体pMA5-P43-vgb。将pMA5-P43-vgb转化B.subtilisNX-2，通过抗性平板筛选得到阳性克隆，通过SDS-PAGE凝胶电泳以及一氧化碳差光光谱法检测发现，VHb成功的在B.subtilis NX-2中表达出有生理活性的蛋白，γ-PGA发酵生产结果显示在400 r/min条件下，VHb的表达可以极大地促进菌体生长，最大菌体干重增加了41.2％，γ-PGA产量提高了7.5％。 4、研究了谷氨酸消旋酶基因(racE)及γ-PGA合成酶基因(pgsBCA)对γ-PGA合成及立体构型的影响，结果表明racE基因不是γ-PGA合成的必需基因，当胞内缺失RacE时，外源添加D-谷氨酸可以合成γ-PGA。而γ-PGA中D/L-谷氨酸的比例由PgsBCA和RacE共同调控。对PgsB、PgsC、PgsA进行生物信息学分析，结果表明:PgsB蛋白不含有跨膜区，它与ATP结合并催化ATP的水解，为γ-PGA合成提供能量;PgsC蛋白保守性最高，其含有4个跨膜区域，是疏水性膜结合蛋白;PgsA为亲水性稳定蛋白，在N端存在1个跨膜区域。并且，pgsB、pgsC、pgsA都是γ-PGA合成的必需基因，缺一不可。为了考察pgsBCA基因的重要性，构建了包含有P43强启动子、pgsBCA基因的重组表达载体pHY300-p43-pgsBCA，将重组表达载体转化Bsubtilis NX-2获得pgsBCA基因过表达的重组菌B.subtilis NX-2(p43-pgsBCA)，γ-PGA发酵生产结果显示过表达pgsBCA基因有效的促进了γ-PGA合成，γ-PGA产率较原始菌提高了12.3％。 5、为了进一步降低生产成本，采用糖蜜和味精废水为原料进行γ-PGA发酵研究。结果显示，以未处理糖蜜为碳源时，B.subtilis NX-2补料分批发酵生产γ-PGA的产量达到50.2±0.53 g/L，生产强度0.52±0.002 g/L/h。将味精废水用于γ-PGA的发酵生产可以减少谷氨酸一半的用量。最终以未处理糖蜜和味精废水为原料进行γ-PGA补料分批发酵生产，得到γ-PGA产率52.1±0.52 g/L，生产强度0.54±0.003 g/L/h，并可以节约52.6％的原料成本，实现了低成本、高效率的γ-PGA生产。在100 L、1 M3、10 M3发酵罐上开展了γ-PGA的逐级放大生产研究，在10 M3发酵罐上的多批次发酵结果显示γ-PGA产量均高于50g/L，初步实现了γ-PGA的产业化生产。
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