摘要
目的：构建分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(zmp1)基因的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，对Zmp1重组融合蛋白进行纯化；构建分枝杆菌zmp1基因与增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)融合的真核表达载体，验证其在RAW264.7细胞中的表达；探讨Zmp1蛋白对RAW264.7细胞的增殖活性、细胞周期、细胞凋亡以及吞噬体-溶酶体融合的影响。 方法： 1.以卡介苗（BCG）基因组DNA为模板，采用PCR法扩增zmp1基因；定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中，构建重组原核表达载体pET-32a(+)-zmp1；转化入大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，纯化获取Zmp1重组蛋白，表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。 2.以BCG基因组DNA为模板，采用PCR法扩增zmp1基因；定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点中，构建重组真核表达载体pEGFP-N1-zmp1，并转染RAW264.7细胞，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达，实时定量PCR(qRT-PCR)检测zmp1基因mRNA的表达水平。 3.用Zmp1重组蛋白作用RAW264.7细胞后24h，CCK-8法检测细胞的增殖活力；作用后48h，流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡。 4.将载体pEGFP-N1-zmp1瞬时转染RAW264.7细胞后24h，CCK-8法检测细胞的增殖活力；转染后48h，流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡。 5.减毒鼠伤寒沙门氏菌(SL7207)感染 RAW264.7细胞(已转染载体pEGFP-N1-Zmp1或Zmp1重组蛋白作用)，采用沙门氏菌荧光抗体和溶酶体相关膜蛋白标志物荧光抗体双标记，通过荧光显微镜观察Zmp1蛋白阻止吞噬体-溶酶体融合的作用。 结果： 1.PCR法扩增出zmp1基因；定向克隆构建的原核表达载体pET-32a(+)-zmp1，经双酶切及基因测序鉴定构建正确；经IPTG诱导在大肠杆菌BL21（DE3）中表达出重组Zmp1融合蛋白，相对分子量约为94kDa，大小与预期融合蛋白相符；Western blot结果显示重组Zmp1融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。 2.PCR法扩增出zmp1基因；定向克隆构建的真核表达载体pEGFP-N1-zmp1，经双酶切及基因测序鉴定构建正确；质粒转染的RAW264.7细胞中观察到绿色荧光表达；qRT-PCR结果显示转染pEGFP-N1-zmp1的RAW264.7细胞zmp1的表达显著升高。 3.采用Zmp1重组蛋白细胞外作用RAW264.7细胞，在24～96h观察到细胞增殖活力有所下降；细胞周期在S期被阻滞；早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率均有所增加。 4.将载体pEGFP-N1-zmp1转染RAW264.7细胞，在48～96h观察到细胞增殖活力有所下降；细胞周期在S期和G2期被阻滞；早期细胞凋亡率有所增加。 5.Zmp1重组蛋白组和pEGFP-N1-zmp1细胞转染组，双荧光融合数量变化不大，影响吞噬体-溶酶体融合差异不明显。 结论： 1.成功构建了zmp1基因原核表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmp1融合蛋白表达。 2.成功构建了zmp1基因真核表达载体，并在RAW264.7细胞中获得重组Zmp1融合蛋白表达。 3.Zmp1蛋白能够抑制RAW264.7细胞的增殖活性、细胞周期、细胞凋亡，影响吞噬体-溶酶体融合效果不明显，为重组BCG疫苗的开发奠定基础。
NETL