摘要
斑节对虾（Penaeus monodon）是我国重要的传统养殖虾类，但由于对其性腺发育调控机制的了解不清晰，育种过程中缺乏人工可控的性腺催熟技术，育种技术理论的升级受到制约。因此，了解性腺发育过程中的调节机制，探索发育相关激素的分泌规律及作用机制有重要意义。促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)是一种十到十二肽的神经激素，在动物的繁育中发挥重要作用。为了获知GnRH的在斑节对虾神经系统中的分泌规律、功能和作用机制，本研究利用组织切片，免疫组化，体外组织培养，反向液相色谱等方法研究了GnRH在斑节对虾神经系统中的分布及变化，确定了GnRH对卵巢发育成熟的诱导作用，并初步建立了斑节对虾GnRH分离纯化的方法。具体研究结果如下： （1）斑节对虾神经系统和卵巢组织结构 通过石蜡切片，HE染色的技术研究了斑节对虾神经系统及卵巢的形态学及组织学结构。结果表明斑节对虾神经系统是由脑，围食道神经，胸神经及腹神经节高度愈合而成，脑位于眼柄基部，由前脑，中脑，后脑和相连的神经束组成，脑中神经分泌细胞根据直径分为三类，分别为小型，中型及大型神经分泌细胞，根据在脑中的分布位置分为6-17神经分泌细胞群。在食道下神经，胸腹神各神经节也是由神经纤维及神经分泌细胞组成。斑节对虾卵巢分为六个期，其中成熟期（V期）卵子呈皮质杆状体。卵巢具有自发荧光现象，主要集中于滤泡细胞以及富含卵黄颗粒的次级卵母细胞、成熟卵母细胞的细胞质区域,荧光强度与卵巢发育阶段具有显著正相关性（P<0.01）。可根据荧光强度初步判断卵巢发育分期。 （2） GnRH在斑节对虾生殖发育期神经系统及卵巢中免疫定位 利用免疫组化及定量PCR的方法研究了GnRH在斑节对虾卵巢发育五个时期（II至VI期）中在神经系统及卵巢中的免疫定位，以及在卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原的表达规律。结果显示阳性信号主要分布于脑、胸神经节的一些中型神经分泌细胞群，并且 GnRH免疫阳性在各神经节的神经纤维中普遍分布，同时在次级卵母细胞也检测到免疫阳性。其次，GnRH-I类似物在斑节对虾 III期脑组织中显示较强的免疫阳性，显著聚集在中型神经分泌细胞细胞质中，呈现高表达水平；然而在卵巢中 GnRH-I类似物仅在成熟期 V期次级卵母细胞与初级卵母细胞的细胞间隙中发现免疫阳性。定量PCR结果显示在发育不同时期中，肝胰腺卵黄蛋白原mRNA表达趋势与卵巢中不同，提示斑节对虾神经系统分泌GnRH-I型类似物，诱导卵巢成熟，在此过程中，肝胰腺卵黄蛋白原向卵巢转移。 （3）GnRH体外培养对斑节对虾卵巢发育的影响 采用离体卵巢组织培养的方法研究了中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）促性腺激素释放激素（EsGnRH-I）、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)促性腺激素释放激素（PcGnRH），多巴胺拮抗物地欧酮（DOM）及神经组织对斑节对虾卵巢发育的调控作用效果。结果表明：50 ng?ml-1 EsGnRH-I，500 ng?ml-1 PcGnRH，0.3μg?ml-1 DOM对离体卵巢的发育有明显的刺激作用，显著增大卵母细胞直径（P<0.01），与脑组织，胸神经处理组效果相似；同时组合使用 PcGnRH和DOM能极显著促进卵母细胞发育（P<0.01）。荧光定量PCR结果显示PcGnRH和DOM处理后能显著增加卵黄蛋白原的积累量。说明甲壳类动物 GnRH和DOM均能促进斑节对虾卵母细胞成熟，并具有协同作用。 （4）斑节对虾脑组织GnRH的初步分离纯化 采用反向液相色谱的方法对斑节对虾脑组织中 GnRH类似物进行初步分离，调节初步分离的纯化参数，得到理想的分离图谱，并利用 EsGnRH抗体对分组分进行斑点免疫实验鉴定。结果表明，斑节对虾卵巢发育初期即II期和III期，脑组织粗提液分离组分较多，且在优化的条件下，22-26min收集的组分具有免疫阳性，初步确定小量分离纯化方案。该研究为大量纯化并剖析斑节对虾 GnRH氨基酸结构提供数据基础。
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