摘要
海蜇（Rhopilema esculentum）隶属于刺胞动物门、钵水母纲、根口水母目、海蜇属，作为一种大型的可食用经济水母，在我国海洋渔业中占有重要地位。其基础生物学研究深入，人工繁育、增养殖技术成熟，是研究水母发育过程基因表达调控及水母毒素组成、结构和功能的理想模式生物。 本研究在454转录组测序的基础上，通过EST序列分析、cDNA末端快速扩增（RAC E）技术从刺胞动物门的海蜇中克隆获得两个磷脂酶 A2基因cDNA全长序列（命名为RePLA2-1、RePLA2-2）、两个穿孔蛋白基因cDNA全长序列（命名为 RePFP-1、RePFP-2），并对这些基因进行了原核表达及重组蛋白功能分析。详细结果信息如下： 1、RePLA2-1基因cDNA全长为824bp，开放阅读框（ORF）504bp，能够编码167个氨基酸。预测RePLA2-1的分子式为C833H1283N235O241S15，推测的半衰期为30h，不稳定指数为61.93，属于不稳定蛋白。亲水性平均数（GRAVY)为-0.124，推测该蛋白为水溶性蛋白。根据氨基酸序列预测的分子量和等电点分别是18.93KDa和8.02。RePLA2-2基因cDNA序列全长840bp，预测的开放阅读框（ORF）包含495个核苷酸，编码165个氨基酸序列。N-端前23个核苷酸为信号肽，5’非编码区(UTR)和3’非编码区 UTR分别包含6个核苷酸和336核苷酸。预测RePLA2-2的分子式为C844H1278N228O232S13，分子量和等电点分别是18.747KDa和8.94。推测的半衰期为30 h，不稳定指数为32.64，属于稳定蛋白。亲水性平均数（GRAVY)为-0.276，推测该蛋白为水溶性蛋白。利用overlap PCR技术，获得了RePLA2-1、RePLA2-2基因组全长序列。RePLA2-1基因组序列全长2937bp，由4个外显子和3个内含子。ReP LA2-2基因组序列全长2113bp，由2个外显子和1个内含子组成。Blast比对结果显示，RePLA2-1、RePLA2-2属于Phospholip_A2_3家族。系统进化分析表明，RePLA2-1、RePLA2-2与僧袍芋螺、星状海葵、长牡蛎毒素PLA2聚为GIX PLA2一支，与GXIII、GXII PLA2家族成员共聚为pfam-collection。荧光定量PCR显示，蜇RePLA2-1、RePLA2-2基因在海蜇不同发育阶段均有表达。其中，RePLA2-1在海蜇水螅体发育阶段及横裂体发育阶段具有较高表达量。在横裂体发育阶段RePLA2-1 mRNA达到四个发育阶段的最高值，为碟状体阶段的12.2倍；其次为水螅体体阶段，为水碟状体阶段的7.6倍；水母体阶段也达到了碟状体阶段的5.5倍。RePLA2-2在海蜇水母体、碟状体发育阶段具有较高表达，分别为横裂体阶段的10.8倍和4.4倍。在水螅体阶段表达量为横裂体阶段表达量的1.3倍，无明显差异。以海蜇cDNA为模板，设计特异性引物扩增RePLA2成熟肽部分，进行原核表达。重组蛋白以包涵体的形式表达，经纯化、透析复性后获得的重组蛋白能够水解大豆卵磷脂。 2、获得的海蜇RePFP-1 cDNA全长2303bp，包含1883bp的开放阅读框，能够编码610个氨基酸，3’UTR包括一个多腺苷酸Poly(A)尾和一个多腺苷酸化加尾信号AATAAA。RePFP-1基因组全长5786bp，由7个外显子6个内含子组成，所有内含子外显子的剪切位点均符合 GT-AG剪切规则。RePFP-2 cDNA全长2212bp，包含1842bp的开放阅读框，编码613个氨基酸，3’UTR包括一个多腺苷酸Poly(A)尾和一个多腺苷酸化加尾信号AATAAA。RePFP-2基因组全长8609 bp，由8个外显子7个内含子组成，所有内含子外显子的剪切位点均符合 GT-AG剪切规则。RePFP-1和RePFP-2之间氨基酸序列相似率为65%，都含有N端MACPF结构域，与其他穿孔蛋白不同的是RePFP-1和RePFP-2蛋白C端均含有一个卵黄膜外层蛋白I结构域（VMO I）。将RePFP-1和RePFP-2与穿孔素、补体等含MACPF结构域穿孔蛋白家族成员氨基酸序列进行进化分析，结果表明RePFP-1和RePFP-2氨基酸序列与原生生物聚为一簇。利用实时荧光定量PCR技术，我们对RePFP-1和RePFP-2 mRN A在海蜇水螅体、横裂体、碟状体和幼水母体四个典型发育阶段进行了相对表达量检测，结果表明，尽管RePFP-1和RePFP-2在海蜇四个发育阶段都具有表达，但在早期发育水螅体阶段有明显的表达上调，而在幼水母体阶段表达量较低。因此，结合 VMOI在其他生物卵子发生过程中的作用我们推测RePFP-1和RePFP-2蛋白可能并不仅是作为毒素起作用，还可能参与海蜇早期发育的调控。在RePFP-1和RePFP-2 MACPF结构域两端分别设计引物，以海蜇cDNA为模板扩增海蜇 PFP蛋白 MACPF结构域部分，并构建原核表达重组质粒pet28-RePFP-1和pet28-RePFP-2，将重组质粒转化到表达菌株 BL21(DE3)感受态细胞，并实现了重组表达。但是，重组表达的蛋白经纯化、透析复性后并无抑菌活性。
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