摘要
目的：由于中国人食品营养素构成比例结构变化、饮酒习惯的变化等多因素的作用下，酒精性肝病（Alcoholic liver diseae;ALD）在我国的发病有逐年增高的趋势，乙醇及其代谢产物诱导的肝细胞的损伤导致的肝损伤正继病毒性因素导致的肝损伤后成为我国肝脏疾病的又一重大因素。人参作为一种我国及周边国家发现其药用价值历史较长的中药材，具有调节免疫、抗氧化的功效。人参皂苷Rg1是采用现代工艺从人参中采集的一种单体成分，本实验通过体外实验加之进一步的动物实验观察人参皂苷Rg1对乙醇介导的L-O2细胞损伤的功能改善作用及大鼠酒精性肝炎的疗效及其机制研究，并进一步研究Rg1在对抗乙醇及其代谢产物引起肝脏炎症反应作用中的信号通路和可能机制，为开发防治酒精性肝病药物提供理论依据。 第一部分:人参皂苷Rg1对乙醇诱导的L-O2细胞损伤的保护作用机制研究 方法：以L-O2细胞株为对象，选择对该细胞存活率无显著影响的Rg1浓度，L-O2细胞随机分为Rg1组（包括0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L三个浓度组）、模型组、正常对照组，Rg1组给予0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L三个浓度的Rg1保护，Rg1组以及模型组均给予乙醇诱导损伤。提取细胞培养液中上层清液测肝功（AST、ALT、TBiL）；ELISA检测炎症因子IL-1、IL-6、TNF-a的表达量；westernblot定量检测凋亡因子Casepase1、Caspase3、Caspase8、NF-kB、细胞色素P450E1(CYP2E1)的表达量；流式细胞学方法测细胞凋亡水平；ELISA检测氧化应激相关指标：谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、活性氧簇（ROS）表达量；在透射电镜下观察细胞线粒体等超微结构改变。 结果： 1.取培养细胞上层清亮液体测肝功及炎症因子提示：Rg1组ASL、ALT两项指标均较模型组低，其中Rg1浓度为1.0g/L、1.5g/L的两组与模型组比较有统计学意义；Rg1组炎症因子IL-1、IL-6、TNF-a的表达量均较模型组低，各组与模型组两两比较有统计学意义。 2.收集细胞采用蛋白印迹法检测Casepase1、Caspase3、Caspase8、NF-kB、细胞色素P450E1(CYP2E1)的表达量结果提示：Rg1组CYP2E1、NF-κB两项指标均较模型组低，其中Rg1浓度为0.5g/L、1.0g/L组与模型组两两比较有统计学意义;Rg1组浓度为1.0g/LCaspase3、Caspase8较模型组均低，有统计学意义；浓度为0.5g/L的Rg1组Casepase1表达量低于模型组，有统计学意义。 3.流式细胞学方法测定细胞凋亡水平：Rg1各实验组细胞凋亡率均低于模型组，与模型组两两比较均有统计学意义。 4.ELISA检测氧化应激相关指标：GSH-Px、ROS表达量：Rg1组GSH-Px表达量明显比模型组高，有统计学意义；Rg1浓度为0.5g/L及1.0g/L的组ROS浓度较模型组低，有统计学意义。 5.透射电镜观察细胞：模型组、Rg1组细胞电镜下观察均显示细胞肿胀，胞质内线粒体及内质网较正常组增多，模型组内找到明显肿大的线粒体髓鞘及大片状的内质网。 结论：Rg1对乙醇诱导的L-O2细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能通过抑制炎症因子释放、抑制凋亡及抗氧化应激等多种机制缓解乙醇诱导的L-O2细胞损害，从而发挥保护肝细胞的作用。 第二部分:人参皂苷Rg1对大鼠酒精性肝炎的治疗作用及机制探讨 方法：采取持续酒精灌胃的方式建立酒精性肝炎的动物模型[5-6]。将雌性SD大鼠随机的分为正常组、模型组、Rg1组、地塞米松组，模型组、Rg1组、地塞米松组分别给予同等剂量的生理盐水、Rg1及地塞米松灌胃治疗组。检测大鼠血清肝功及炎症因子相关指标，观察肝脏炎性变和脂肪变及凋亡指数,免疫组化、Western blot及RT-PCR分别检测Caspase3、Caspase8、NF-Kb及其蛋白水平及mRNA水平表达改变。 结果： 1.模型构建完成后，病理检查证实模型组大鼠肝脏1/3以上的肝细胞出现脂肪变性，呈现典型的酒精性脂肪肝病理表现。 2.经观察疗效120h后，Rg1组及地塞米松组的肝功指标及炎症因子水平均较模型组低（p<0.05，p<0.05）。 3.免疫组化检测Caspase3、Caspase8、NF-KB模型组表达量明显高于Rg1组和地塞米松组（p<0.05，p<0.05）。TUNEL染色示模型组凋亡指数高于地塞米松组及Rg1组（p<0.05,p<0.05）。 4.实时荧光定量PCR检测caspase3、caspase8、NF-KB mRNA Rg1组及地塞米松组均低于模型组（p<0.05）, Rg1组以上各项水平较地塞米松组低（p<0.05）。 5.Western blot检测caspase3、caspase8、NF-KB蛋白表达Rg1组及地塞米松组均低于模型组（p<0.05）。Rg1组以上各项水平低于地塞米松组(p<0.05）。 结论：人参皂苷Rg1通过阻断凋亡通路以及抑制炎症因子的释放,可显著缓解酒精性肝炎大鼠的病理损伤，改善肝脏功能。
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