摘要
目的: 以TNIP1调节角质形成细胞增殖为切入点探讨银屑病易感基因TNIP1在银屑病发病机制中可能的生物学作用以及机制研究。 方法: (1)应用免疫组化(immunohistochemistry, IHC)、免疫印迹和实时定量逆转录多聚酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测银屑病表皮TNIP1蛋白和基因水平; (2)应用免疫荧光结合激光共聚焦检测HaCaT细胞内源性TNIP1蛋白表达情况，并检测自行分离培养的人原代角质形成细胞(primary human keratinocyte，PHK)全角蛋白AE1/AE3的表达情况; (3)设计、合成特异性抗TNIP1短发夹干扰RNA(small interfering hairpin RNA，shRNA)TNIP1 shRNA和重组TNIP1(recombinant TNIP1，rTNIP1)，并以慢病毒为载体，分别感染角质形成细胞和BALB/c小鼠; (4)应用qRT-PCR和免疫印迹分别检测TNIP1 shRNA HaCaT/PHK细胞和rTNIP1 HaCaT/PHK细胞的TNIP1 mRNA水平和TNIP1蛋白水平; (5)应用活体小动物成像、免疫印迹分别检测BALB/c小鼠感染慢病毒后荧光表达情况和TNIP1蛋白水平，并用免疫组化检测局部IκBα、IL-1b、TNF-α和IL-1a等细胞因子表达水平; (6)应用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK8)、ELISA BrdU和免疫印迹检测细胞角蛋白6(cytokeratin6，CK6)水平分别评价角质形成细胞感染慢病毒后的增殖能力; (7)应用免疫印迹检测慢病毒感染角质形成细胞的Erk1/2水平和磷酸化Erk1/2(phosphorylation of Erk1/2，p-Erk1/2)水平，并用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)研究在HaCaT细胞TNIP1是否与Erk1/2相互作用， (8)应用Erk1/2特异性抑制剂抑制Erk1/2磷酸化，再用免疫印迹检测慢病毒细胞的CK6蛋白水平; (9)应用免疫印迹检测慢病毒感染角质形成细胞的C/EBPβ水平; (10)构建、合成抗C/EBPβ的特异性小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，以抑制角质形成细胞的C/EBPβ水平，并用免疫印迹检测细胞的CK6蛋白水平; (11)采用咪喹莫特(imiquimod，IMQ)-诱导BALB/c小鼠银屑病样皮炎动物模型，对小鼠背部涂抹区域的红斑、鳞屑和皮肤粗糙、隆起情况进行评分、统计分析，并行皮肤组织组织病理检查，观察局部炎细胞浸润和角质形成细胞增殖情况。 结果: (1)银屑病皮损表皮与正常皮肤比较，其TNIP1基因水平、CK6基因水平显著升高;TNIP1蛋白表达显著降低，而CK6蛋白表达显著增强。TNIP1蛋白水平降低可能参与了银屑病的发病。皮内注射慢病毒下调小鼠局部皮肤TNIP1蛋白水平后，会加剧IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎临床表现（红斑、鳞屑、皮肤隆起评分及总评分）提示TNIP1对银屑病样皮炎有保护作用; (2)通过检测CK6基因/蛋白水平、CCK8增殖实验、ELISA BrdU实验，一致证实HaCaT/PHK细胞增殖受TNIP1蛋白水平变化的调节。下调TNIP1表达导致细胞增殖增强，而上调TNIP1则抑制细胞增殖; (3)免疫共沉淀Co-IP证实HaCaT细胞TNIP1与Erk2相互作用。角质形成细胞的TNIP1水平上调后，其p-Erk1/2和C/EBPβ表达被抑制;TNIP1表达下调则导致角质形成细胞的p-Erk1/2和C/EBPβ表达增强。推测TNIP1可能通过Erk1/2和C/EBPβ调节角质形成细胞增殖。在TNIP1水平下调的前提下，分别抑制TNIP1shRNA HaCaT细胞的p-Erk1/2或C/EBPβ水平后，会导致细胞CK6蛋白水平降低，推测TNIP1部分通过p-Erk1/2或C/EBPβ来调节角质形成细胞增殖能力(CK6表达水平)。 结论: 银屑病患者皮损处表皮的TNIP1蛋白水平降低，而mRNA水平升高。下调小鼠皮肤局部TNIP1蛋白水平，会加剧IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎表现，提示TNIP1对银屑病有保护作用。在体外TNIP1蛋白水平下调后会促进角质形成细胞的增殖，反之，则抑制增殖。推测TNIP1可能通过调节角质形成细胞增殖参与银屑病致病。我们的研究显示TNIP1有望成为银屑病治疗的生物治疗靶点之一。
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