摘要
本实验室前期研制了伊枯草菌素A高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisZK85 L发酵罐规模上的分批发酵工艺和“氮源+碳源+氨基酸”补料模式的补料-分批发酵工艺。本研究比较并总结了两种发酵工艺中菌体的代谢产素规律。采用RT-PCR法比较分析了两种工艺中菌体氮代谢和伊枯草菌素A合成调节的关键基因的表达差异，在此基础上，应用RT-qPCR方法进一步研究了4个表达有差异的基因和伊枯草菌素A合成操纵子itu的差异显著性和相对表达量变化趋势。 具体内容如下: 第一章:两种发酵工艺中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZK8代谢规律比较研究 比较了伊枯草菌素A高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZK8在5L发酵罐中分批发酵工艺和“氮源+碳源+氨基酸”补料模式的补料-分批发酵工艺条件下总氮浓度、还原糖浓度以及16种氨基酸浓度的变化规律，发现两者差异较大。补料-分批发酵工艺在5-9h流加氨基酸补料液，改变了氨基酸补料期间以及发酵后期Asp、Glu、Pro、Ala、Met、Phe、Tyr7种氨基酸的代谢规律，同时总氮浓度下降速率比分批发酵工艺慢;10-15 h流加氮源补料液，总氮浓度维持在1.68g/L左右，总氮浓度高于分批发酵工艺;18-48 h总氮浓度在1.60g/L左右，分批发酵工艺总氮浓度在1.30g/L左右，流加氮源补料液为补料-分批发酵工艺后期提供了更加充足的氮源。补料-分批发酵工艺在9-15h流加碳源补料液，9-28 h还原糖浓度高于分批发酵工艺，还原糖浓度维持在30.7g/L左右。菌体在两种发酵工艺中表现出不同的生长规律和伊枯草菌素A合成趋势:在6h进入对数生长期，分别在13h和15h进入稳定期，补料-分批发酵工艺中菌株指数生长期延长3h，分批发酵工艺和补料-分批发酵工艺最大生物量分别为2.44×1010cell/mL和4.12×1010 cell/mL，提高了68.85％，总效价提高了36.67％。 第二章:两种发酵工艺中菌株关键调控基因表达差异研究 采用半定量RT-PCR法比较分析了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZK8的6个氮代谢调控基因（glnA、gltAB、gltC、tnrA、glnR和rocG）和5个脂肽合成调控相关基因(degQ、degUS、comAP、sfp和codY)在两种发酵工艺中的表达差异，结果显示glnA、gltAB、gltC、tnrA、comAP和sfp6个基因的表达无差异，rocG条带不明显，glnR、codY、 degQ和degUS4个基因表达有差异。在此基础上，采用RT-qPCR法进一步研究了glnR、codY、 degQ和degUS4个基因和伊枯草菌素A合成操纵子itu的差异显著性和相对表达量变化规律。结果表明补料-分批发酵工艺中degQ、degUS和glnR3个基因的相对表达量均高于分批发酵工艺，而codY相对表达量均低于分批发酵工艺，itu表达规律与伊枯草菌素A合成趋势相似。其中，degQ在24 h时表达差异显著(P＜0.05); degUS在18h、24 h和36h时差异显著(P＜0.05); glnR在18h、24 h和36 h时差异显著(P＜0.05);codY在18h、24 h和36 h差异显著(P＜0.05); itu在伊枯草菌素A快速合成期(12-24 h)相对表达量差异显著(P＜0.05)。通过分析4个基因在两种发酵工艺中的相对表达量变化规律，发现degQ、degUS和glnR3个基因在伊枯草菌素A合成的起始期(6-12h)相对表达量均呈上升趋势，伊枯草菌素A快速合成期(12-24 h)相对表达量较高;而codY在发酵后期表达量较高。RT-qPCR法检测了伊枯草菌素A合成操纵子itu相对表达量，发现其表达规律与伊枯草菌素A合成趋势基本一致。
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