摘要
大豆[Glycine max(L.) Merr.]是我国重要的粮饲经济作物，在国民经济中起着重要的作用。提高大豆单产是大豆育种的主要目标。开花期和生育期是影响大豆生产潜力的重要因素。因此，研究大豆开花相关基因的功能，阐明调控大豆开花期的分子机制具有十分重要的科学意义和实践价值。本研究利用生物信息学，找出Tasma等(2001)报道的大豆开花期相关QTL的候选基因，通过分子克隆技术从Corsoy和Kitamishiro亲本克隆出GmELF4基因;通过荧光实时定量PCR技术，分析研究GmELF4基因在大豆中的时空表达模式;明确大豆光周期主效基因E1、E2、E3和E4对GmELF4基因的调控情况。构建GmELF4基因的融合表达载体，并利用拟南芥表皮细胞表达实验进行了亚细胞定位研究;构建GmELF4基因功能互补载体以及CRISPR/Cas9介导的基因沉默载体，有望获得大豆功能互补型和功能缺失型转基因植株。其主要研究结果如下: 1.GmELF4候选基因的克隆 利用生物信息学，找出Tasma等(2001)报道的大豆开花期相关QTL的候选基因Glyma.18G027500。Glyma.18G027500是拟南芥ELF4的同源基因。通过分子克隆以及生物信息学比较分析，结果表明GmELF4基因在两亲本间存在一个SNP位点，这个单碱基的突变导致DUF1313保守结构域上101位点的丝氨酸变成脯氨酸。虽然这个结构域的功能目前尚不明确，但是该结构域的改变很可能造成GmELF4编码蛋白功能改变。 2.GmELF4的时空表达模式 通过荧光实时定量PCR技术，分析表明GmELF4基因在大豆真叶、三出复叶、生长点等各组织器官中广泛表达，在叶片和生长点表达丰度高，可能参与开花过程。此外，GmELF4基因表达呈现24小时节律表达模式。在长日照条件下，其表达高峰出现在ZT16小时附近，而在短日条件下，其表达高峰出现在ZT12小时附近，表明GmELF4基因的节律表达模式受光周期调控。当将长日照条件下生长的植株移至连续光照条件下，GmELF4基因表达量升高，但依然呈现类似于长日照条件下的24小时节律表达模式，说明GmELF4基因受生物钟调控。 3.E1、E2、E3和E4对GmELF4的调控模式分析 通过荧光实时定量PCR技术，分析不同遗传背景下Harosory-NILs中GmELF4基因的表达模式，结果表明，在长日和短日条件下，E1都抑制GmELF4的表达，E3E4促进GmELF4表达;E2在长日条件下，抑制GmELF4的表达，在短日照条件下，促进GmELF4的表达。 4.GmELF4的亚细胞定位 将GmELF4连接至带有报告基因的融合表达载体pBSK中，与对照载体一起共转化拟南芥原生质体。结果显示，GmELF4在细胞质中特异性表达。 5.GmELF4互补试验和基因沉默试验 将GmELF4基因Corsoy型自身启动子加基因全长片段连接入大豆遗传转化载体pTF101.1中，以大豆品种黑农37(gmelf4)为材料，利用农杆菌介导的子叶节法进行大豆遗传转化。目前，正在进行大豆遗传中，预期能够得到功能互补型转基因大豆。利用CRISPR/Cas9技术对GmELF4基因进行DNA水平的编辑，以使GmELF4沉默，目前正在进行大豆遗传转化，预期得到功能缺失型转基因苗。 6.Corsoy和Kitamishiro群体构建 为了进一步验证此开花期相关QTL的候选基因是GmELF4基因，我们以Corsoy作为母本，Kitamishiro作为父本进行杂交，构建近等基因系。打算进一步验证GmELF4基因时此开花相关QTL的候选基因。目前F4代已种植。 综上所述，本研究利用生物信息学发现GmELF4是Tasma等(2001)报道的大豆开花期相关QTL的候选基因。GmELF4基因在两亲本间存在一个SNP位点，从而导致其DUF1313保守结构域上101位点的丝氨酸变成脯氨酸。GmELF4基因与拟南芥ELF4类似，其表达受光周期和生物钟调控。此外，E1抑制GmELF4的表达，E3E4促进GmELF4表达;E2在长日条件下，抑制GmELF4的表达，在短日照条件下，促进GmELF4的表达。因此，我们推测，GmELF4是此QTL的候选基因，参与大豆光周期调控开花途径，但还需进一步验证。
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