摘要
目的:建立可以稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(RFP-GFP-LC3)的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系，为自噬研究提供材料。研究结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)对小鼠巨噬细胞自噬的影响，探究Rab7在结核杆菌毒力因子SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断中的作用。 方法: 1.用分子克隆的方法构建含RFP-GFP-LC3基因的慢病毒重组质粒载体，将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞，收集病毒液上清后感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株，分别用荧光显微镜和流式细胞仪分析感染效率。饥饿处理稳定感染的细胞，荧光显微镜下观察细胞内的RFP-GFP-LC3斑点。 2.分别用SapM、渥曼青霉素、饥饿处理GFP-LC3-RAW264.7细胞。荧光显微镜下观察自噬体的形成，Western blot法检测微管相关性蛋白轻链3(LC3)Ⅱ水平;再用SapM处理GFP-LC3-RAW264.7细胞后加氯喹，Western blot法检测LC3Ⅱ水平。 3.siRab7转染RAW264.7细胞，用蛋白免疫印记检测P62。mCherry-SapM转染RAW264.7后免疫组化分析SapM与Rab7共定位情况，免疫共沉淀分析SapM与Rab7的关系。用三种SapM的突变体SapM△arcA，SapM△FReD和SapM△CT转染RAW264.7细胞，分析SapM的不同突变体与Rab7的关系。 结果: 1.成功构建了慢病毒载体pLV-CMV-RFP-GFP-LC3，经感染和嘌呤霉素筛选获得了稳定表达RFP-GFP-LC3的RFP-GFP-LC3-RAW264.7细胞; 2.SapM和饥饿均导致GFP-LC3斑点增多和LC3Ⅱ水平增高，在SapM处理的细胞中加入氯喹并没有引起LC3Ⅱ的进一步升高。 3.siRab7处理后，细胞P62水平显著增高;免疫组化显示SapM与Rab7在胞内共定位;免疫共沉淀分析显示SapM与Rab7可相互沉淀;三种不同突变形式的SapM中，只有SapM△CT不能与Rab7相互作用。 结论:稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株成功建立，为自噬的研究建立了细胞平台。SapM可阻断自噬体与溶酶体的融合，从而抑制小鼠巨噬细胞自噬。SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断依赖于SapM与Rab7的相互作用。
NETL