USP7稳定Ki-67蛋白促进NSCLC细胞增殖的机制与意义

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中文摘要：研究背景和目的： USP7作为一个去泛素酶在肿瘤的发生发展进程中发挥着一定的作用；Ki-67作为一个细胞增殖的标记分子，同时也参与促进肿瘤的发展与转移。我们在非小细胞肺癌中发现USP7能够调控Ki-67促进癌症的发展。研究方法： 1.应用免疫组织化学方法检测正常肺组织和NSCLC组织中USP7表达；应用Western blot、Real-time PCR方法检测人正常肺上皮细胞Beas2B和NSCLC细胞中USP7蛋白和mRNA；通过在NSCLC细胞中用USP7活性抑制剂P22077及转染USP7 siRNA质粒干预后，运用CCK8和AO-EB双荧光染色法检测细胞的增殖和存活状态。 2.在NSCLC细胞中用P22077及转染USP7 siRNA质粒干预后，通过Western blot检测MCM2、PCNA蛋白表达，通过细胞免疫荧光（CIF）检测Ki-67蛋白表达；运用CIF检测人正常肺上皮细胞Beas2B和NSCLC细胞中Ki-67蛋白表达；运用免疫组织化学方法检测正常肺组织和NSCLC组织中Ki-67表达；通过裸鼠皮下移植瘤实验检测转染USP7 siRNA质粒的A549细胞增殖成瘤体积。 3.通过Real-time PCR检测人正常肺上皮细胞Beas2B和NSCLC细胞中Ki-67mRNA表达和在NSCLC细胞中用P22077及转染USP7 siRNA质粒干预后，Ki-67mRNA的表达情况；应用CIF，在NSCLC细胞中检测USP7与Ki-67的定位情况；应用MG132及转染USP7 C223A突变质粒后，进一步研究USP7对Ki-67的调控机制；通过CCK8实验，检测转染USP7 siRNA质粒后细胞对药物敏感性影响。研究结果： 1.在NSCLC组织中USP7在核内高表达，并且分化程度越低的组织表达越高；与Beas2B细胞相比NSCLC细胞中USP7的蛋白和mRNA均高表达；应用P22077及转染USP7 siRNA质粒检测NSCLC细胞的增殖效率降低，细胞保持存活状态。 2.在NSCLC细胞中应用P22077和转染USP7 siRNA质粒后MCM2、PCNA的蛋白表达不变，Ki-67蛋白表达减少；与Beas2B细胞相比NSCLC细胞中Ki-67的蛋白高表达；在NSCLC组织中Ki-67也在核内高表达，并且分化程度越低的组织表达越高；在A549细胞中转染USP7 siRNA质粒后，细胞裸鼠皮下移植瘤与对照组和NC组比瘤体体积减少显著。 3.在Beas2B和NSCLC细胞Ki-67的mRNA基本一致，在NSCLC细胞中应用P22077、转染USP7 siRNA质粒后，Ki-67 mRNA保持不变；在NSCLC细胞中USP7和Ki-67有共定位现象；MG132拮抗P22077所诱导对Ki-67蛋白表达下调作用，应用MG132后在转染USP7 siRNA细胞中Ki-67蛋白表达恢复；过表达USP7 C223A后，Ki-67蛋白表达减少；转染USP7 siRNA质粒的细胞对药物敏感性无变化，甚至还有所提高。研究结论： 1.USP7在NSCLC组织和细胞中过表达，并且抑制USP7活性或者下调USP7后均可以减慢细胞增殖，但细胞仍存活。 2.USP7可以调控Ki-67的蛋白表达，并且Ki-67在NSCLC组织和细胞中过表达，下调USP7后，裸鼠皮下移植瘤与对照组和NC组比瘤体体积减少显著，同时Ki-67表达也下调。 3.在NSCLC细胞中，USP7通过去泛素作用调节Ki-67的蛋白稳定性。

作者：

张超

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关键词：

非小细胞肺癌 Ki-67蛋白 NSCLC细胞细胞增殖

授予学位：

硕士

学科专业：

肿瘤学

导师：

姜斌、高丰厚、刘峰

学位年度：

2015

学位授予单位：

上海交通大学

语种：

中文

中图分类号：

R73