摘要
目的： 利用Transwell侵袭小室建立具有高转移潜能、高侵袭能力胆囊癌细胞株（GBC-SD）的亚系（GBC-SD-I-2）并研究其生物特性。筛选高低不同转移潜能胆囊癌细胞亚群差异表达蛋白，确定YAP1蛋白差异表达最为显著。研究RNAi介导沉默YAP1基因对GBC-SD-I-2细胞侵袭转移能力的影响。 方法： 一、胆囊癌高转移细胞亚群GBC-SD-I-2的筛选和研究。 对人胆囊癌细胞株GBC-SD进行传代培养，采用涂有 Matrigel基质胶的Transwell小室对传代培养的GBC-SD细胞进行体外侵袭实验，分离回收具有高侵袭、转移特性的细胞亚群GBC-SD-I-2。在光学显微镜下观察GBC-SD-I-2与母系GBC-SD的形态差异。应用MTT法检测GBC-SD-I-2的细胞体外增殖能力，并应用克隆形成试验检测细胞接种存活率，观察细胞群体依赖性和增值能力，观察与母系GBC-SD的区别。应用免疫组化技术及逆转录RT-PCR法检测GBC-SD-I-2与GBC-SD中N-cadherin及β-catenin的表达。 二、不同转移潜能胆囊癌细胞亚群差异表达蛋白的筛选。 把高低不同转移能力胆囊癌细胞株（GBC-SD、GBC-SD-I-2）作为研究对象，用双向凝胶电泳进行总蛋白的分离，两组之间的差异蛋白通过质谱分析技术，蛋白数据库搜索鉴定筛选，用Western Blot法对差异蛋白点进行进一步检测验证。 三、沉默YAP1对胆囊癌GBC-SD-I-2细胞生物学行为的影响 构建YAP1小干扰RNA慢病毒载体，将YAP1-shRNA转染到GBC-SD-I-2，通过RT-PCR、Western Blot检测shRNA消减效率。对转染后的GBC-SD-I-2进行细胞培养、通过 Transwell小室侵袭转移实验及划痕实验检测评估沉默 YAP1基因对胆囊癌细胞运动、侵袭转移能力的影响。 结果： 一、利用Transwell侵袭小室从胆囊癌细胞株中筛选出高转移能力细胞亚群GBC-SD-I-2与母系GBC-SD光镜下观察形态上存在明显差异。MTT法检测GBC-SD-I-2体外生长能力显著强于母系细胞GBC-SD（P<0.05）。克隆形成试验显示亚系增殖能力明显增强，两组差异显著（P<0.01）。RT- PCR及蛋白质印迹法检测显示亚群细胞N-cadherin表达水平明显升高、β-catenin蛋白表达明显降低P＜0.05。 二、利用蛋白组学比较技术共鉴定出高转移能力的胆囊癌细胞株GBC-SD-I-2与低转移能力的胆囊癌细胞系GBC-SD有25个不同意义的蛋白质。在GBC-SD-I-2细胞株中15个蛋白表达明显增高，10个蛋白表达明显降低。对于GBC-SD-I-2细胞株高表达的YAP1，应用Western Blot法在蛋白水平上验证了双向凝胶电泳结果。三、成功构建慢病毒载体沉默 YAP1基因的shRNA质粒。对转染后的GBC-SD-I-2通过RT-PCR检测YAP1 mRNA表达量：实验组 YAP1 mRNA蛋白表达量明显低于阴性对照siRNA转染组和PBS空白对照组(P<0.05)。划痕实验检测沉默YAP1组胆囊癌细胞随意运动力明显减弱，Transwell小室侵袭转移实验提示实验组穿膜的细胞数显著少于阴性对照 siRNA转染组及空白对照组(98±23 vs.112±15﹠132±10，P<0.05)。 结论： 一、筛选的胆囊癌细胞亚群GBC-SD-I-2的侵袭、转移能力明显增强，为探讨胆囊癌转移机制提供理想的实验工具，同时本实验筛选的胆囊癌亚系细胞株也可以用于进一步做化疗及靶向治疗药物的敏感性试验，以便发现更加敏感、高效的治疗胆囊癌药物。二、本次以二维电泳为基础的蛋白质组学研究所得的数十种差异表达蛋白或将成为胆囊癌侵袭转移的分子诊断标志物或靶向治疗作用点。 三、利用慢病毒载体成功构建了高效率沉默YAP1小干扰RNA质粒可显著抑制GBC-SD-I-2细胞侵袭运动转移潜能，为临床靶向治疗胆囊癌提供理论依据。
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