冬虫夏草生境土壤微生物群落研究

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中文摘要：冬虫夏草是我国名贵的传统药材之一，具有很高的药用价值和经济价值，仅产于青藏高原及其周边高海拔地区的高寒草甸或灌丛中。由于受到分布地域的局限以过度采挖的影响，冬虫夏草的产量逐渐下降，早在1999年就被中国政府列入了国家二级保护物种名录。多年来研究人员在冬虫夏草生长环境方面做了大量的研究，但是对冬虫夏草生境中土壤微生物群落的研究尚未深入。随着研究方法的改进和技术手段的提高，本研究采用分子生物学和宏基因组方法如DGGE和高通量测序（Illumina和454焦磷酸测序）结合传统的平板培养方法，研究了冬虫夏草生境不同类型土壤中的微生物群落。本研究的主要结果如下: 1)土壤总DNA提取方法的优化。比较了超声波破碎(破碎时间分别为45 sec、90 sec、180 sec)、商业试剂盒CW和Mobio、液氮研磨等方法的优劣，测定提取DNA的A260、A280紫外吸收值和DNA含量，随后进行DGGE分析中检测重复性和灵敏度，结果显示利用超声波破碎180 sec与冻融、酶解相结合的方法，DNA纯度、含量和DGGE的分析都表现出了一定的优势，为一种最适宜的土壤DNA提取方法。 2)土壤中真菌和细菌的分离鉴定。采用传统的稀释平板法在土壤样品中分离到了大量的真菌和细菌，包括220株细菌和1228株真菌。细菌中Actinobacteria、Proteobacteria、Firmicute和Bacteroidete分离频率最高，在Os（虫草区域的土壤）中Arthrobacter、Flavobacterium、Microbacterium、Oxalobacteraceae和Sporosarcina等的比例要比NOs（无虫草区域土壤）样品中的高;真菌主要类群隶属于Ascomycota、Zygomycota和Basidiomycota，在SMP(菌膜)样品中Geomyces spp.、Helotiales和Paecilomyces spp.的含量较高。 3)通过DGGE分析了土壤细菌和真菌多样性。各个样方以及不同地区的细菌群落结构具有很大的相似性，相似程度达到了75％以上，通过切胶克隆测序得到，土壤中主要存在的细菌隶属于Acidobacteria、Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes。菌群落结构主要为Ascomycota和Basidiomycota。 4)利用高通量测序方法分析了冬虫夏草生境土壤微生物的多样性。利用Illumina测序技术研究冬虫夏草生境中不同类型土壤的细菌多样性，共获得了525000条V6区序列，通过聚类OTU数量变化为13858-15978个，通过rank-abundance分析显示在冬虫夏草的生境土壤中存在大量低丰度的类群，细菌的多样性在Os和NOs中并没有显著性的差异。所得到的序列隶属于23个不同的门，包括Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Verrucomicrobia等。通过Veen图显示在Os、NOs以及SMP中共有7183个OTUs，其中863个OTUs是Os和SMP所共有的，隶属于12不同的门;在菌膜中Proteobacteria、Actinobacteria含量相对较高。利用454焦磷酸以ITS为靶标研究了冬虫夏草生境土壤中真菌群落，得到的18955条序列隶属于11个类群，包括Ascomycota(54.16％)、Basidiomycota(8.58％)、Mortierellomycotina(5.57％)、Glomeromycota(0.14％)、Chytridiomycota(0.10％)和Mucoromycotina(0.06％)。对各个样品进行聚类分析显示，样品并没有根据土壤的类型和有无虫草进行聚类，彼此之间没有显著的差异;NMDS显示SMP与其他的样品差异较大，有27个唯一的OTU，并且大部分属于Ascomycota和Basidiomycota,其中Ascomycota的含量最大。 5)评估真菌ITS、ITS1以及ITS2在多样性研究中的应用。利用ITSx软件提取UNITE数据库中完整的ITS、ITS1和ITS2的序列，对三个不同的片段进行聚类分析，结果显示，ITS1比ITS2和ITS具有更高变异性，ITS2的聚类组成比ITS1更接近于ITS，分类信息相似;454焦磷酸数据组模拟分析，提取出的ITS1或者ITS2聚类OTU数量远远小于相对应的无处理数据组得到的OTU数量（至少有三倍的差异），本研究建议利用ITSx软件处理序列，根据测序方向抽提出ITS1或者ITS2后进行聚类，才有可能得到相对比较客观的真菌多样性以及丰度。

作者：

杨瑞恒

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关键词：

冬虫夏草高通量测序土壤微生物多样性群落结构

授予学位：

博士

学科专业：

微生物学

导师：

姚一建

学位年度：

2015

学位授予单位：

中国科学院大学

语种：

中文

中图分类号：