摘要
研究背景： 骨关节炎是一种骨科常见病，在老年人中发病率较高，其主要病理改变是关节软骨损伤退变。由于软骨组织是一种无血液供应、无神经及淋巴组织分布的组织，因此自我修复能力较差。骨关节炎的主要症状是关节疼痛和活动度受限，影响病人日常生活，甚至导致丧失劳动能力，给家庭和社会造成严重的社会负担和经济负担。目前治疗骨关节炎的方法有限，最有效的方法是人工关节置换术。但由于该手术的花费较高，且不可避免假体松动、下沉等远期并发症。如能探索出更为简单有效的治疗方法具有良好的社会效益和经济效益。 间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一种来源于中胚层的干细胞，具有多向分化潜能，目前广泛应用于组织工程及再生医学。而应用组织工程技术修复软骨组织具有较好的应用前景，已有研究显示关节腔注射 MSCs可修复骨关节炎的软骨缺损。MSCs治疗骨关节炎软骨缺损的关键是将MSCs分化为关节软骨细胞，如果能促进 MSCs软骨分化则可促进其对软骨缺损的修复作用。胎盘间充质干细胞（Placenta Derived Mesenchymal Stem Cells，PMSCs）是一种胎盘来源的MSCs。由于其来源于胚胎组织，具有更高的增值活性及分化能力。如果将PMSCs应用于骨关节炎的软骨修复则能有更好的结果。 有研究显示在胚胎肢体发育过程中，抑制血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）表达可促进胚胎干细胞向软骨组织分化，而在成体干细胞中也有研究显示抑制 VEGF表达可促进其软骨分化，并能促进干细胞对骨关节炎软骨缺损的修复。而在干细胞软骨分化过程中有多种信号通路参与调节，其中最重要的是Notch信号通路，但其具体作用机制尚未明确。因此本研究设想主动调控Notch信号通路，观察其对PMSCs软骨分化的影响，寻找出能促进PMSCs软骨分化的调控方法。然后采用联合调控VEGF与Notch信号通路的方法促进 PMSCs的软骨分化，进一步将其运用到内侧半月板切除（Destabilization of the Medial Meniscus，DMM）骨关节炎动物模型中，观察其对软骨修复的作用。 研究目的 首先观察不同Notch信号通路调控方式对PMSCs软骨分化的影响，寻找出能促进PMSCs软骨分化的调控方式。然后采用联合调控VEGF与Notch信号通路的方法，观察其对PMSCs软骨分化的影响。构建小鼠膝关节骨关节炎模型，将联合调控VEGF与Notch信号通路的PMSCs注射入关节腔，观察其对膝关节软骨缺损修复的效果，为骨关节炎的治疗提供新的理论支持。本研究分为以下三个部分： 第一部分：调控VEGF与Notch信号通路对PMSCs软骨分化的影响 方法： （1）培养 PMSCs，流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD29，CD34、CD73、CD90、CD105、CD166的表达。 （2）分别应用成骨、成脂及成软骨分化培养基诱导 PMSCs分化，观察其多向分化潜能。碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Runx2、Osteocalcin基因表达水平鉴定其成骨分化能力；油红O染色，PPARγ、C/EBPa基因表达水平鉴定其成脂分化能力；阿利新蓝染色、II型胶原（Col-II）免疫组织化学染色及Aggrecan、Col-II及Sox9基因表达水平鉴定其成软骨分化能力。 （3）应用VEGF受体抑制剂SU5416抑制VEGF信号通路，观察其对PMSCs软骨分化的影响。 （4）应用Notch信号通路抑制剂 LY411575抑制 Notch信号通路及 Notch信号通路配体蛋白Jagged1激活Notch信号通路，观察其对PMSCs软骨分化的影响。根据处理方式不同，实验分为6组：①正常对照组；②Notch7d组：在分化前7天添加Notch信号通路抑制剂LY411575；③Notch21d组：在分化全过程（21天）添加LY411575；④Jag17d组：在分化前7天添加Jagged1蛋白；⑤Jag121d组：在分化全过程添加Jagged1蛋白；⑥Jag17d+Notch14d组：分化前7天添加Jagged1蛋白+分化后14天添加LY411575。 （5）联合调控VEGF与Notch信号通路，观察其对PMSCs软骨分化的影响，实验分为4组：①正常对照组；②VEGFRi组：分化全过程添加VEGF受体抑制剂SU5416；③Jag17d组：分化前7天添加Jagged1蛋白；④VEGFRi+Jag17d组：分化全过程添加SU5416+分化前7天添加Jagged1蛋白。 结果： （1）流式细胞仪检测表面标志物结果显示，PMSCs表达 CD29、CD73、CD90、CD105、CD166，阳性率分别为100%、100%、100%、54.7%、93.1%，不表达CD34，阳性率为0%。 （2）经过诱导，PMSCs可成功分化为成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞，证实PMSCs具有多向分化潜能。 （3）抑制VEGF信号通路后，Pellet内阿利新蓝染色阳性区域及Col-II蛋白的表达水平比对照组高。软骨标志基因Col-II、Aggrecan、Sox9的表达量较对照组升高。证实抑制VEGF信号通路可促进PMSCs的软骨分化。 （4）应用不同方法调控Notch信号通路后发现，Notch7d组、Notch21d组与Jag17d+Notch14d组均明显抑制PMSCs的软骨分化。Jag121d组的软骨分化水平与正常组无明显差异。Jag17d组的PMSCs软骨分化水平明显高于对照组。证实早期激活Notch信号通路可促进PMSCs的软骨分化，而抑制Notch信号通路可明显抑制其分化，无论抑制时间长短。 （5）联合调控VEGF与Notch信号通路后发现，VEGFRi+Jag17d组的软骨分化水平高于VEGFRi组与Jag17d组。证实联合调控VEGF信号通路与Notch信号通路对PMSCs的软骨分化有协同作用。 第二部分：小鼠膝关节骨关节炎模型的构建 方法： （1） DMM手术操作：取大腿外侧切口，用显微外科剪沿髌韧带内缘剪开关节囊，分离周围软组织，完整切除内侧半月板。 （2）标本处理：术后4周、8周、12周各处死6只模型小鼠，另取6只正常小鼠做对照。解剖双下肢，福尔马林固定72小时。固定后脱钙，之后石蜡包埋、切片。 （3）结果鉴定：H&E染色观察膝关节整体结构，阿利新蓝染色及番红 O染色观察膝关节软骨基质情况；OARSI组织学评分评估各标本骨关节炎程度；Col-II、Aggrecan免疫组织化学染色观察软骨面内基质蛋白表达情况；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察胫骨平台软骨下骨破骨细胞活动情况；骨赘大小评分及骨赘成熟度评分分析各组膝关节胫骨平台骨赘形成情况。 结果： （1）膝关节组织学分析：DMM术后4周小鼠膝关节胫骨平台内侧软骨面已有磨损，但关节面尚完整，未见软骨面破裂，关节磨损处软骨面内蛋白多糖含量减少，呈现出早期骨关节炎改变。DMM术后8周时小鼠膝关节内侧胫骨平台软骨面磨损较重，软骨面破裂，关节面不完整，残留软骨较少，关节软骨面内蛋白多糖含量减少，呈现出典型骨关节炎改变。DMM术后12周时小鼠膝关节内侧关节间隙磨损严重，胫骨平台已基本无软骨残留，软骨下骨裸露，胫骨平台软骨下骨硬化，呈重度骨关节炎改变。 （2）DMM术后4周组的OARSI评分为3±0.6，高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）；DMM术后8周组的OARSI评分为10.8±1.3，明显高于术后4周组（P<0.05）；DMM术后12周的OARSI评分为15.8±1.2，明显高于术后8周组（P<0.05）。证实DMM造模手术的关节退变程度呈渐进性发展。 （3）正常膝关节软骨面内Col-2及Aggrecan蛋白表达量较高，随着DMM手术造模时间的推移，软骨面内Col-2及Aggrecan的蛋白表达量逐渐减少，证实骨关节炎发生时伴有软骨基质蛋白的丢失。 （4）DMM造模4周时胫骨平台软骨下骨破骨细胞数量较多，而在术后8周时破骨细胞数量开始下降，到术后12周时恢复至正常水平。 （5）DMM术后4周时可发现胫骨平台周围有骨赘形成，随着造模时间的推移，骨赘逐渐增大且成熟度逐渐升高。 第三部分：调控VEGF与Notch信号通路对PMSCs修复骨关节炎软骨缺损的动物实验研究 （1）DMM造模：同第二部分。 （2）关节腔注射PMSCs：在DMM造模后4周进行关节腔注射PMSCs治疗，每周注射一次。根据细胞处理方法不同分为5组：①Control组：关节腔注射培养基；②PMSCs组：关节腔注射 PMSCs；③P+V组：关节腔注射PMSCs+SU5416；④P+J组：关节腔注射PMSCs+Jagged1；⑤P+V+J组：关节腔注射PMSCs+SU5416+Jagged1。 （3）CM-Dil标记追踪PMSCs：用CM-Dil试剂标记PMSCs，追踪PMSCs注射入关节腔后生物活动轨迹。 （4）标本处理：在关节腔注射治疗后4周及8周时，每组各处死6只动物，收集双膝关节标本。固定后脱钙，脱钙14天后石蜡包埋、切片。 （5）结果鉴定：H&E染色观察膝关节整体结构，阿利新蓝染色及番红 O染色观察膝关节软骨修复情况；OARSI组织学评分评估各标本骨关节炎治疗效果；Aggrecan、Col-II、Col-X免疫组织化学染色观察修复软骨面内基质蛋白表达情况；脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）染色观察膝关节软骨细胞凋亡情况。 结果： （1）将CM-Dil标记的PMSCs注射入DMM小鼠关节腔内，注射后4周时仍可见荧光标记的PMSCs，证实PMSCs注射后可长期在关节腔内存活。 （2）膝关节组织学分析：治疗4周及8周后发现，PMSCs组膝关节胫骨平台内侧有软骨修复，关节面尚光滑，未见软骨破裂，但修复的软骨层较薄，软骨基质较少；P+V组与P+J组膝关节软骨修复情况比PMSCs组好，软骨较厚且软骨基质较多；P+V+J组软骨修复效果最好，透明软骨层较厚，软骨基质染色阳性区域大且染色较深，明显优于其他各组。OARSI评分也证实了同样的结果。 （3）PMSCs组修复的软骨层内可见有Col-2、Aggrecan蛋白表达，但表达量较低，而退变软骨标志蛋白Col-X的蛋白表达量较高，证明PMSCs组修复的软骨质量较差。P+V组与 P+J组修复软骨面的Col-2、Aggrecan蛋白表达量较Control组高，而Col-X的蛋白表达量较Control组低，证实P+V组与P+J组修复软骨面的软骨质量较 Control组高。而 P+V+J组修复软骨面内的Col-2、Aggrecan蛋白表达量比其他组都高，而 Col-X的蛋白表达量比其他组都低，证实P+V+J组修复软骨质量最高，接近于正常的软骨组织。 （4）PMSCs组的TUNEL染色阳性细胞数少于Control组，差异有统计学意义（P<0.05），证实关节腔注射PMSCs可以抑制关节软骨细胞凋亡。P+V组与P+J组的TUNEL染色阳性细胞数量明显少于PMSCs组（P<0.05）。而P+V+J组的TUNEL阳性细胞数明显少于其他组（P<0.05），证实 P+V+J组可以更好的抑制软骨细胞凋亡。 结论： （1）PMSCs具有多向分化潜能；抑制VEGF信号通路可以促进PMSCs的软骨分化；早期激活 Notch信号通路也可以促进其软骨分化；联合调控 VEGF与Notch信号通路对PMSCs的软骨分化有协同作用。 （2）DMM手术可成功构建小鼠膝关节骨关节炎模型，且病变程度呈渐进性发展，适合用于骨关节炎研究。 （3）关节腔注射 PMSCs对小鼠骨关节炎软骨缺损有修复作用，联合调控VEGF及Notch信号通路可促进PMSCs对骨关节炎的软骨修复。
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