摘要
本研究通过对CQW1株（GenBank登录号:KM233707.1）鸭坦布苏病毒(DuckTembusu virus，DTMUV)进行纯化、形态结构观察后，将纯化病毒灭活、免疫健康雏麻鸭，获得鸭抗DTMUV的免疫血清;以此病毒株的核酸为模板，RT-PCR扩增具有较强免疫原性的E基因，并采用原核表达系统对其进行体外表达;基于E基因表达的重组蛋白，首次建立了快速检测DTMUV血清抗体的胶体金免疫层析试纸条。研究的主要内容归结如下: 1.DTMUV的纯化、形态学观察及其高免血清制备 将CQW1分离株病毒接种9日龄的健康鸭胚，收集接种48 h后死亡鸭胚的尿囊液。采用蔗糖密度梯度（60％、45％和30％）离心纯化DTMUV，透射电镜观察病毒粒子的形态结构。结果显示，在45％～60％蔗糖交界层，镜下可见较多的纯净病毒粒子，大小约为50nm，具有核心、囊膜和突起结构。将纯化的病毒经甲醛灭活，制得免疫抗原后接种健康雏鸭，双向琼脂扩散试验测定免疫鸭血清效价，获得效价为1∶32的鸭抗DTMUV血清，为后续实验奠定了基础。 2.DTMUV截短E基因的克隆与表达 将CQW1分离株的E基因序列进行生物信息学分析，截去其跨膜区并选取免疫原性较强的基因片段设计特异性引物，RT-PCR扩增截短E基因，将其克隆至pET-32a(+)载体后转入Ecoli Rosetta(DE3)表达菌进行诱导表达与分析。结果表明，扩增的截短E基因片段经测序分析为1206 bp，与预期结果一致;重组菌经IPTG诱导，成功表达出大小约65 KDa的重组E蛋白;Western-blot分析，发现该蛋白与抗DTMUV鸭血清有特异性反应，表明其具有免疫学活性。 3.快速检测DTMUV血清抗体的胶体金免疫层析试纸条建立与应用 将胶体金溶液分别标记重组E蛋白和羊抗鼠IgG，并以E蛋白作为检测线，鼠IgG作为质控线，制备可检测DTMUV血清抗体的试纸条。通过试验条件的优化，结果表明，胶体金颗粒与重组E蛋白、羊抗鼠IgG最适标记pH分别约为6.8和6.7;1 mL胶体金溶液的最佳蛋白、羊抗鼠IgG标记量分别为5.5μg和17.0μg。将试纸条分别检测抗DTMUV、抗鸭圆环病毒(Duck circovirus，DuCV)、抗鸭甲肝病毒3型(Duckhepatitis virus type3，DHAV-3)、抗鸭乙肝病毒（Duck hepatitis B virus，DHBV）、抗鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)、抗鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）、抗大肠杆菌（Escherichia coli，E coli）和抗肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis，SE)鸭血清，结果显示仅检测抗DTMUV鸭血清的试纸条为阳性。用试纸条检测经1∶21、1∶22……1∶210稀释后的鸭抗DTMUV血清，结果显示，该试纸条可检测1∶28稀释的血清。采用该试纸条和文献报道的ELISA方法同时检测217份临床鸭血清样品，分析表明，两种方法的检测符合率达到97.24％。
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