摘要
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，1991年首次发现于加拿大。PMWS临床特征主要有断奶仔猪呼吸困难、腹泻、黄疸、明显的淋巴组织病变和进行性消瘦。猪场中PCV2感染率高，建立灵敏而快速的分子诊断方法有助于对该疾病进行早期诊断，有助于控制PCV2的传播，有助于种猪进出口时快速灵敏地进行病原体的检验检疫。本研究建立了一种新型的、灵敏的并且操作简单的PCV2微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)定量检测方法,将其应用于检测种猪血清样品、猪内脏组织、PCV2疫苗半成品中PCV2病毒含量的情况，并与TaqMan荧光定量PCR(TaqMan flurogenicquantitative PCR，qPCR)方法进行比较验证，获得满足出入境检验检疫需求的猪圆环病毒高效灵敏的检疫方法。本研究主要内容及结果如下: 1.PCV2 ddPCR检测方法的建立 根据PCV2中国株(ZJG1103)的基因全长，设计PCR扩增引物，并成功扩增出全基因组，通过连接与转化后，将全基因构建到pMD19-T载体上，成功制备了PCV2重组质粒标准品pMD-PCV2。根据GenBank中登录的PCV2 ORF2基因序列(KC823059.1)，设计并合成一对特异性引物及探针，在进行引物探针浓度和PCR退火温度的优化后，分别建立了PCV2的qPCR和ddPCR检测方法。两种方法的线性关系试验表明，在9.85×105～12.5拷贝/μL的检测范围内，ddPCR与qPCR均具有良好的线性关系(R2=～1)，当质粒标准品被稀释到108倍以下时，qPCR已无明显的扩增曲线，而ddPCR仍可检测到具有荧光信号的阳性微滴，其最低检测极限约25拷贝/μL,敏感性比qPCR高4倍，ddPCR表现出更宽的动态检测范围。利用建立的PCV2ddPCR方法检测PCV1、PRV、PPV、PRRSV和CSFV的核酸，结果均呈阴性，表明该方法特异性强，检测结果可靠。重复性试验中，组内试验和组间试验变异系数(CV％)均小于3％，表明建立的ddPCR检测方法重复性好且稳定性高，可用于后期检测临床样品。 2.PCV2 ddPCR检测方法的初步应用 用本研究建立的ddPCR检测107份来自疑似发病猪场的种猪血清样品，ddPCR和qPCR的核酸阳性检出率分别为84.1％和80.4％。Kappa分析比较两种方法的实验结果，Kappa系数为0.89（SE=0.06，95％置信区间），表明两种检测方法之间有良好的符合率。另外，用建立的PCV2 ddPCR和qPCR方法检测猪内脏组织样品，核酸阳性检出率分别为41.7％和29.2％，ddPCR表现出更高的灵敏度。最后，用ddPCR和qPCR方法分别检测PCV2疫苗半成品中的病毒含量，ddPCR定量检测结果与传统的TCID50方法测定的结果更一致。因此，本研究建立的ddPCR检测方法可以用于多种临床样品PCV2的定量检测。
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