摘要
皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino），自然分布于我国的辽东及山东半岛，是最具经济价值的贝类养殖品种之一。自20世纪80年代以来，我国皱纹盘鲍养殖业发展迅猛，养殖区域由黄海北部逐步南扩至福建沿海、广东东部沿海等地。养殖范围的大幅扩增及“南北调养”模式的不断发展，使皱纹盘鲍面临环境变化的几率急剧增加。即使在同一海域，受暴雨、潮汐、大陆径流等影响，海水的温度、盐度等因子常处于大幅变动之中。温度和盐度是海洋中的重要环境因子，它们不仅限制海洋生物的地理分布和养殖范围，还影响其存活、生长、表观遗传修饰等重要生物学过程。本文以“97”选育群体为实验材料，系统研究了温度、盐度对皱纹盘鲍生长发育的影响，确立了各发育阶段的适宜温盐范围，以期为人工养殖提供生态学参考;同时还探索了不同温盐条件下幼鲍DNA甲基化的变化模式，旨在揭示皱纹盘鲍响应温盐胁迫的表观遗传学机制，并为其抗逆品种的培育提供表观遗传学依据。 1.温度、盐度对皱纹盘鲍精子活力和受精率的影响 利用计算机辅助精子分析(computer-assisted sperm analysis，CASA)，检测了不同盐度下皱纹盘鲍的精子活力;同时，以受精率为评价指标，确定了受精阶段的适宜温度、盐度范围。结果表明，盐度对皱纹盘鲍的精子活力具有极显著影响(P＜0.01)。5～50内，随着盐度的升高，皱纹盘鲍的精子活率、(A+B)级精子比例、直线运动速度、曲线运动速度和平均路径速度均呈现先升高后降低的趋势。综合上述指标，确定皱纹盘鲍精子的适宜盐度为26～40。该范围内，精子活率大于90％，(A+B)级精子比例大于85％，精子直线运动速度高于80μm/s，曲线运动速度高于100μm/s，平均路径速度高于95μm/s。 温度、盐度对皱纹盘鲍受精率的影响极显著(P＜0.01)。14～28℃内，皱纹盘鲍均可受精，20℃时，受精率最高，为94.84％;28℃时，受精率最低，为14.39％。20～24℃内，受精率均在85％以上，为皱纹盘鲍受精的适宜温度。皱纹盘鲍受精的盐度上限为42，下限为22，对应的受精率分别为4.46％和1.59％。皱纹盘鲍受精阶段的适宜盐度为30～34，该范围内受精率为85.05～94.84％。 2.温度、盐度对皱纹盘鲍胚胎发育的影响 观测了不同温度下的胚胎发育进程，并记录受精卵发育至二细胞、四细胞、八细胞、纤毛环形成和孵化的时间。结果表明，温度影响皱纹盘鲍的胚胎发育速率。16～26℃内，随着温度的升高，胚胎发育速率加快，孵化时间由18.19 h逐步缩短至8.72 h。通过拟合胚胎发育时间与温度的关系，得出研究所用皱纹盘鲍的生物学零度为6.98℃。 以孵化率和畸形率为评价指标，研究了温度、盐度单一及组合效应对皱纹盘鲍胚胎发育的影响，并利用响应曲面法估测了胚胎发育的适宜温盐范围。单因子实验结果表明，胚胎发育的适宜温度为16～24℃(32)，适宜盐度为30～34(20℃)。双因子实验结果表明，胚胎发育的最适温盐组合为16.5～22.5℃和31～33，该条件下的孵化率≥95％，畸形率≤5％。双因素方差分析表明，温度、盐度及其组合效应对胚胎孵化率和畸形率均有极显著影响(P＜0.01)，其中盐度效应强于温度效应。 3.温度、盐度对皱纹盘鲍变态及变态幼体生长存活的影响 采用室内受控方法研究了温度、盐度对皱纹盘鲍变态及变态幼体生长存活的影响。结果表明，水温对变态率、变态幼体存活率和生长率的影响极显著(P＜0.01)。14～28℃内，随着水温的升高，幼体变态率、变态幼体存活率和生长率均呈现先升高后降低的趋势。24℃时变态率最高，为86.05％;18℃时，变态幼体存活率最高，为96.00％;26℃时，投苗6d内的壳长、壳宽生长率最大，分别为48.49μm/d和43.81μm/d;投苗15d内的壳长、壳宽生长率最大，分别为68.06μm/d和59.69μm/d。 盐度对皱纹盘鲍变态率及变态幼体生长率的影响极显著(P＜0.01)，对幼体存活率却无显著影响(P＞0.05)。22～40内，幼体变态率先升高后降低，于32达最大值，为79.23％;变态的盐度下限为22，该盐度下仅有2.21％的个体能够完成变态。26～40内，变态幼体存活率均高达85％以上;随着盐度的升高，变态幼体生长率先升高后降低。投苗6d内壳长、壳宽生长率均于34达最大值，分别为32.03μm/d和25.20μm/d;投苗15d内壳长、壳宽生长率分别于34和32达最大值，为43.03μm/d和39.00μm/d。 4.温度、盐度对皱纹盘鲍幼鲍生长存活的影响 以存活率和特定生长率为评价指标，研究了温度、盐度单一及组合效应对皱纹盘鲍幼鲍的影响，确定了幼鲍阶段的最适温盐条件。单因子实验结果表明，幼鲍阶段的适宜温度为16～28℃(32)，存活的温度上限为30℃;24℃时生长最快，壳长、壳宽和湿重的特定生长率分别为0.83％/d、0.79％/d和2.47％/d。幼鲍的适宜盐度为24～40(20℃)，盐度上、下限分别为44和18，对应的存活率分别为8.33％和11.67％。双因子实验结果显示，幼鲍的最适温盐组合为23～25℃和30～36。双因素方差分析表明，温度、盐度及其组合效应对幼鲍的存活率和特定生长率均具有显著影响;其中，在存活率方面，盐度效应强于温度效应，而在特定生长率方面，温度效应强于盐度效应。 5.温度、盐度对皱纹盘鲍幼鲍DNA甲基化的影响 以不同温度(20℃、24℃、30℃)和盐度(22、32、42)条件下培养的幼鲍为实验材料，利用MSAP（methylation-sensitive amplified polymorphism）技术进行DNA甲基化分析，探索了不同温度、盐度下幼鲍DNA甲基化的变化模式。MSAP分析表示，皱纹盘鲍幼鲍基因组DNA的总甲基化水平为33.19％，其中全甲基化水平为22.25％，半甲基化水平为10.95％。不同温度、盐度处理组间的甲基化水平无显著差异。通过对每个甲基化敏感多态性位点甲基化频率的检测，在温度、盐度处理组中各筛选出了67和63个甲基化差异位点。其中，低温组中筛选出的差异位点数为48个，高温组为20个;低盐组为40个，高盐组为33个。利用单标记分析法，检测了甲基化差异位点与表型性状的关联性。从温度、盐度处理组中各检测到23个甲基化位点与生长性状相关联。组间特征值分析表明，温度、盐度胁迫分别了引起了8.5％和6.6％的组间表观遗传差异;从分析图上可看出，不同温度、盐度处理组的表观遗传结构发生了明显分化。
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