摘要
目的: 流行性乙型脑炎又称日本脑炎(Japanese encephalitis)，是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染所引发的人畜共患的自然疫源性疾病。乙脑在世界范围内传播，尤其是东亚、东南亚、大洋洲北部地区为乙脑流行的主要地区，这些地区覆盖了全球超过30亿的人口。世界卫生组织每年报告的乙型脑炎患者约有35，000-50，000人，死亡人数高达15，000人，存活患者中约有30％-50％会留下麻痹症、智力障碍等永久性神经损伤后遗症。近年来随着全球化进程的加速、疫区旅游人数的增加以及病毒自身变异的影响，乙脑的发病率有逐步上升的趋势，在局部地区存在乙脑疫情的暴发与流行。由此可见，乙型脑炎仍然是对世界公共卫生安全的严重威胁，急需深入研究JEV致病机理，提供更加有效的预防手段并寻找新的抗病毒策略。 病毒感染宿主细胞是一个复杂的过程，为形成对靶细胞有效的感染，病毒必须先侵入至细胞内。病毒颗粒需要跨过细胞膜屏障并穿过拥挤的细胞质到达细胞核周特定的区域释放基因组，才能启动复制过程并依次完成后续的蛋白合成、组装与释放。病毒入侵过程也是病毒自身与宿主细胞相互作用的过程，研究表明JEV入侵靶细胞可分为三个步骤:首先JEV通过包膜蛋白E结合至靶细胞表面受体并与之相互作用形成病毒-受体复合物，然后病毒通过受体介导的内吞作用以内吞小体的形式跨过细胞膜进入细胞内并运输至特定的位置，最后病毒通过膜融合作用完成病毒膜与内体膜融合从而释放病毒核酸。目前，对黄病毒科病毒的入侵机制研究主要集中在西尼罗病毒(WNV)以及登革病毒（DENV）上，而对JEV的研究相对较少。对JEV入侵的深入研究，不仅可以解析病毒的感染机制，也可为黄病毒科病毒入侵机制的研究提供借鉴，更可探寻到新的有效的抗病毒靶点，从而在起始阶段来阻断病毒感染。 JEV感染具有嗜神经性，易造成严重的中枢神经系统(CNS)疾病及其并发症，这也是导致乙型脑炎患者发展为重症甚至死亡的主要原因。JEV在体内扩增后，经血液循环，能够突破血脑屏障侵入中枢神经系统从而致病。然而，目前针对JEV感染神经系统的分子机制尚不清楚。我们前期研究发现JEV入侵神经细胞在内吞途径上不同于JEV入侵其它非神经类宿主细胞，可能与JEV的嗜神经性和致病性高度相关。本课题在前期研究的基础上，利用干扰RNA文库对140个宿主细胞跨膜运输相关分子在JEV入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞过程中的具体功能进行研究，并筛选出能够抑制JEV入侵神经细胞的宿主分子。在此基础上应用针对不同宿主分子和信号通路的化学抑制剂以及显性抑制突变体系统分析JEV感染SK-N-SH细胞所依赖的途径及关键分子。旨在探寻参与JEV入侵神经系统的关键宿主分子，阐明JEV入侵神经细胞的路径及调节机制。 一、乙型脑炎病毒入侵神经细胞的关键宿主分子筛选以及内吞途径鉴定 方法: 采用人跨膜转运分子的小干扰RNA文库筛选能够抑制JEV感染人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的宿主分子，并采用JEV假病毒系统鉴定参与JEV入侵的关键分子。联合运用针对不同细胞内吞途径的化学抑制剂作用、关键分子显性抑制突变体的表达、激光共聚焦技术等分析JEV入侵所依赖的内吞途径。 结果: 经过JEV以及JEVpv两轮筛选得到参与病毒入侵SK-N-SH细胞的一组宿主细胞分子。这些分子涵盖了多个不同的功能蛋白种类，包括介导细胞内吞的关键分子小窝蛋白1(Caveolin1)与发动蛋白2（Dynamin2）;细胞骨架肌动蛋白重排相关调节分子CFL1、PAK1、RAC1、RHOA、ROCK2;信号转导通路相关分子GRB2、PIK3C2G、PIK3CG;内体分选与运输调节分子RAB5A、RAB5C、VAPA;内体酸化调节分子V-ATPase。对JEV内吞途径的分析表明JEV入侵依赖小窝介导的内吞途径，入侵过程可促进Caveolin1分子的磷酸化并与Caveolin1分子共定位。JEV内吞依赖Dynamin2的作用，但JEV入侵不依赖网格蛋白介导的内吞途径以及细胞巨胞饮作用。病毒内吞入细胞后依赖Rab5功能但不依赖Rab7功能。 结论: JEV入侵SK-N-SH细胞途径为小窝介导的发动蛋白2依赖型的内吞途径。其它内吞途径，如网格蛋白介导的内吞途径以及巨胞饮作用不参与JEV对SK-N-SH细胞的入侵。JEV在内吞入靶细胞后依赖Rab5的功能在胞内运输。 二、细胞骨架肌动蛋白调节乙型脑炎病毒入侵神经细胞的机制 方法: 采用各Rho GTPase分子的干扰RNA、显性抑制突变体、特异性化学抑制剂，以及联合运用免疫共沉淀、激光共聚焦等技术手段对细胞骨架肌动蛋白重排在JEV入侵SK-N-SH的作用环节与各分子的精细调节机制进行分析。 结果: JEV入侵SK-N-SH细胞依赖细胞骨架的功能，能够促进肌动蛋白的重排。JEV入侵依赖Rho GTPases家族RhoA与Rac1分子对肌动蛋白的调节作用而不依赖Cdc42分子。RhoA与Rac1分子均通过下游Cofilin分子调节肌动蛋白的重排。然而，RhoA与Rac1分子在JEV入侵过程中的不同时间点发挥作用，JEV介导的RhoA激活早于Rac1分子。RhoA与Rac1分子在介导JEV入侵过程中发挥了不同的作用，RhoA激活促进caveolin1分子的磷酸化，而磷酸化的Caveolin1分子激活了Rac1从而促进了病毒的内吞。对微管蛋白的作用分析发现微管主要在病毒内化入细胞后发挥作用而不影响病毒内化的过程。 结论: Rho GTPase家族分子RhoA与Rac1通过两步式的肌动蛋白重排调节机制介导JEV入侵SK-N-SH细胞。 三、表皮生长因子受体在乙型脑炎病毒入侵神经细胞中的作用及其机制 方法: 分别采用针对EGFR及其下游信号分子PI3K的化学抑制剂作用、RNA干扰、细胞因子作用，蛋白相互作用分析等实验技术手段系统分析EGFR及PI3K/AKT信号通路在JEV参与入侵SK-N-SH细胞中的功能及调节机制。并采用激光共聚焦，免疫共沉淀等技术手段分析细胞膜脂筏在JEV入侵SK-N-SH细胞中的作用。 结果: 酪氨酸酶抑制剂Genistein作用表明JEV入侵SK-N-SH细胞依赖酪氨酸激酶作用。JEV入侵可促进EGFR磷酸化作用，当下调EGFR或阻断EGFR功能可抑制病毒入侵。动力学实验表明EGFR参与JEV入侵的早期阶段。阻断EGFR及其下游PI3K/AKT信号通路均抑制了病毒介导的RhoA与Rac1的激活以及caveolin1分子磷酸化作用。病毒入侵促进了脂筏在细胞膜上的区域化聚集，MβCD/Filipin化学抑制剂可阻断病毒入侵所依赖的信号通路的激活，从而阻断病毒侵入SK-N-SH细胞。 结论: EGFR-PI3K信号通路参与了JEV入侵的起始，EGFR通过其下游直接的效应通路PI3K/AKT信号调节了病毒入侵所依赖的RhoA与Rac1分子的激活以及后续病毒内化所依赖的信号通路的激活。 小结: 尽管JEV可以感染多种生物以及多种不同组织类型的细胞，对人类而言其最主要的威胁还在于感染中枢神经系统，引发脑炎。JEV侵入神经细胞是乙脑发病的前提，JEV主要利用宿主细胞元件和内吞机制侵入神经细胞，这种入侵方式一方面帮助病毒跨过细胞膜以及拥挤的细胞质等多道屏障到达病毒复制位点，另一方面以这种类似运输货物的方式侵入有助于病毒逃避宿主细胞免疫系统的监视。本课题在干扰RNA文库筛选的基础上系统研究了JEV入侵神经细胞的途径及调节机制。研究表明:(1)JEV通过小窝(Caveolin1)介导的，发动蛋白Dynamin2依赖型的内吞途径侵入SK-N-SH细胞。(2)JEV入侵SK-N-SH细胞需要Rho GTPases家族成员RhoA以及Rac1介导的两步肌动蛋白重排，RhoA通过调节细胞肌动蛋白骨架重排促进了Caveolin-1的磷酸化作用及其在胞膜上的聚集，从而形成利于病毒入胞的结构区域;磷酸化的Caveolin-1引发了Rac1的激活，Rac1使得病毒通过Caveolin1介导的囊泡内吞途径入侵细胞。(3)EGFR-PI3K信号通路参与了JEV入侵的起始，介导了RhoA的激活以及后续病毒依赖的信号通路的激活。(4)病毒内吞入细胞内后运输至Rab5阳性的内吞小体内。这项研究工作阐明了JEV入侵人神经母细胞瘤细胞的详细机制，鉴定并阐明了JEV入侵神经细胞所依赖的关键分子及其精确的调控机制，并对细胞在病毒入侵过程中所发生的一系列复杂反应进行了深度解析。这些发现不仅有助于更好地认识JEV的感染机制，为进一步理解其它脑炎病毒的入侵机制提供重要的借鉴，而且提供了可以用来预防和治疗JEV感染的新靶点。
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