摘要
背景与目的: 微囊藻毒素（Microcystins, MCs）是最常见的藻类毒素，目前已发现有90多种异构体，其中微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR, MC-LR）是最常见的、毒性最强的异构体。MC-LR对鱼类和体外培养的哺乳动物细胞具有雌激素样作用，是一种内分泌干扰物，而内分泌干扰物可导致体内激素水平紊乱进而影响人类、鱼类、哺乳动物的正常繁殖、生长发育。 随着环境污染的加重，人类生育能力的降低与环境暴露的关系受到全球范围内的关注，MCs对生殖细胞的毒性作用及其机制成为环境毒理学的一大热点。但目前关于MCs诱导生殖系统损伤方面的研究主要集中于雄性生殖系统，其毒性机制也多局限于线粒体通路的研究，而内质网应激-自噬信号通路在MCs对雌性生殖系统毒性作用机制尚不十分明确。深入研究内质网应激-自噬信号通路在MCs对生殖系统毒性作用机制，对保护生殖健康、预防和治疗相关生殖系统疾病有着极其重要的现实意义和前瞻性意义。 方法: 1.应用水溶性四唑盐（WST）-8法，采用CCK-8试剂盒，检测1，5，10，15，20，30μM MC-LR作用中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster cells, CHO）24 h后细胞增殖抑制率的变化，计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)，设置IC50/4、IC50/2、IC50为后续实验浓度。 2.碘化丙啶染色法联合流式细胞术，检测不同浓度 MC-LR染毒CHO细胞24 h后细胞周期的变化； 3.用2’,7’-二氯荧光素乙酰乙酸盐(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)荧光探针法联合流式细胞术，定量检测不同浓度 MC-LR染毒 CHO细胞24 h后细胞内活性氧荧光强度值变化； 4.采用荧光探针Fluo3-AM法和流式细胞术，检测不同浓度MC-LR和ROS抑制剂NAC+不同浓度MC-LR处理CHO细胞24 h后细胞内Ca2+的含量； 5.采用单丹磺酰戊二胺（monodansylcadaverine, MDC）染色法，应用活细胞工作站和流式细胞术检测不同浓度MC-LR处理CHO细胞24 h后细胞内自噬小体的含量； 6.采用蛋白免疫印记技术检测不同浓度 MC-LR以及内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)+IC50 MC-LR染毒24 h后，CHO细胞中内质网应激标志性蛋白GRP78、ATF-6、IRE1、XBP1、CHOP和自噬标志性蛋白 LC3B、Beclin1蛋白相对表达量变化； 7.使用AnnexinV-PE/7-ADD双染色法及流式细胞仪，检测不同浓度MC-LR以及4-PBA/3-MA+IC50 MC-LR染毒CHO细胞24 h凋亡率的变化。 8.所有计算和统计分析均采用SPSS21.0 for Windows统计软件包，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（One Way ANOVA）。进行组间两两比较时，若方差齐时，采用Student-Newman-Keuls test（SNK）检验；若方差不齐时，采用Games-Howell检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.细胞增殖检测结果在本次实验的 MC-LR作用浓度和时间下，MC-LR能抑制CHO细胞增殖，随着MC-LR浓度的升高，和对照组（0μM MC-LR）相比，细胞增殖受到明显抑制，差异有统计学意义（P<0.05）。经计算 MC-LR作用CHO细胞24 h时IC50为10μM，后续实验浓度分别为：2.5μM,5μM和10μM。 2.细胞周期实验结果浓度为0，2.5，5，10μM MC-LR作用于CHO细胞24 h后，处于G2/M的CHO细胞随着MC-LR染毒浓度的增加显著增加（P<0.05），提示MC-LR能够使CHO细胞周期紊乱，从而引起细胞增殖率降低。 3. ROS测定结果 MC-LR染毒CHO细胞24 h后，随着染毒浓度的增加，细胞内荧光强度逐渐增强，也反映出 CHO细胞内 ROS含量升高，染毒组与对照组（0μM）相比，差异有统计学意义（P<0.05）。 4.细胞内Ca2+实验结果 MC-LR染毒CHO细胞24 h后，随着MC-LR浓度的增加，CHO细胞内Ca2+荧光强度逐渐升高，且各染毒组结果与对照组相比有统计学意义（P<0.05）。各实验组CHO细胞在MC-LR染毒前1 h预染了ROS的抑制剂NAC后再染毒24 h，检测细胞内Ca2+含量，实验结果显示虽然随着染毒浓度的增加，Ca2+荧光强度逐渐增强，但NAC+染毒组与对应染毒组相比，荧光强度全有所下降，且差异有统计学意义（P<0.05）。 5.自噬小体检测结果随着MC-LR浓度的增高，细胞内自噬小体的数量和亮度都逐渐增加。流式检测结果显示当暴露时间一定时，随着MC-LR浓度的升高，CHO细胞内自噬小体的含量呈逐渐上升趋势，且和对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 6.内质网应激和自噬标志性蛋白实验结果 Western blot结果分析显示浓度为2.5,5,10μM MC-LR组内质网应激标志性蛋白GRP78、ATF-6、PERK、IRE1、CHOP表达都升高，自噬标志性蛋白Beclin1和LC3II表达升高，LC3I表达降低，且与对照0μM MC-LR组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）；10μM MC-LR染毒组在预先1 h分别加入自噬抑制剂3-MA和内质网应激抑制剂4-PBA时，自噬抑制剂3-MA能够升高内质网应激标志性蛋白的表达，而内质网应激抑制剂4-PBA能降低自噬标志性蛋白的表达。实验结果表明，MC-LR诱导的 CHO细胞凋亡过程中，内质网应激的发生能促进自噬的发生，而自噬增强能够抑制内质网应激的发生。 7.细胞凋亡率检测结果 MC-LR能增加CHO细胞的早期和晚期凋亡率，总凋亡率随着染毒浓度的增加而增加，与对照组（0μM）相比，差异有统计学意义（P<0.05）。当10μM MC-LR组预先1 h加入内质网应激抑制剂4-PBA时， CHO细胞凋亡率明显降低；10μM MC-LR实验组预先1 h加入自噬抑制剂3-MA时，CHO细胞凋亡率明显增加，且与10μM组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 1.在MC-LR处理的CHO细胞中，MC-LR可明显抑制细胞增殖，引起细胞周期阻滞在G2/M期，并诱导其凋亡； 2. MC-LR能诱导CHO细胞ROS增多，从而促进Ca2+水平升高，可能引起内质网应激的发生； 3.内质网应激通路促进凋亡的发生，而自噬作为一种保护机制能抑制凋亡的发生，内质网应激-自噬在MC-LR诱导CHO细胞凋亡过程起着重要作用。
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