摘要
目的：研究乙酰化龙眼肉多糖和羧甲基化龙眼肉多糖的最佳制备工艺。研究龙眼肉多糖、乙酰化龙眼肉多糖和羧甲基化龙眼肉多糖在体外的抗氧化作用，并采用体内、外试验法研究龙眼肉多糖乙酰化和羧甲基化衍生物的免疫活性，阐述龙眼肉多糖及其衍生物的抗氧化和免疫调节机制，为龙眼肉多糖的产业开发提供科学依据。 方法：1.采取水提醇沉法从龙眼肉中获取龙眼肉粗多糖，蛋白酶解法脱去蛋白质，H2O2氧化法脱去色素，透析法去除小分子物质，并用苯酚-硫酸法测定龙眼肉粗多糖中的糖含量。2. DEAE-52纤维素层析柱和Sephacryl S-300 HR层析柱对除杂后的龙眼肉多糖进一步纯化，获取均一多糖组分LYP2。3.选取乙酸酐作为乙酰化试剂制备乙酰化龙眼肉多糖（Ac-LYP2），以Ac-LYP2的取代度（DS）为指标，使用响应面分析法优化Ac-LYP2的制备工艺。4.在氢氧化钠-一氯乙酸（MCA）体系下制备羧甲基化龙眼肉多糖（CM-LYP2），以CM-LYP2的DS为指标，使用响应面分析法优化CM-LYP2的制备工艺。5.测定Ac-LYP2和CM-LYP2的总还原能力，对羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（O2·-）清除效果；考察Ac-LYP2和CM-LYP2在体外对小鼠肝脏脂质过氧化的抑制作用以及H2O2诱导的红细胞溶血的保护作用。6.利用环磷酰胺腹腔注射小鼠制备免疫抑制模型，研究Ac-LYP2和CM-LYP2对免疫抑制小鼠免疫系统的保护作用，在试验过程中采用脾脏指数（SI，Spleen Index）观察Ac-LYP2和CM-LYP2对免疫抑制小鼠免疫器官的影响；通过建立小鼠迟发型变态反应模型并根据耳肿胀程度来评价小鼠的细胞免疫功能；通过检测小鼠血清中的溶血素含量评价其体液免疫功能；通过检测小鼠血清和脾脏中的溶菌酶含量来评价小鼠的非特异性免疫功能。检测血清INF-γ和IL-4含量评价Ac-LYP2和CM-LYP2对Th1/Th2免疫应答模式的影响。7.研究Ac-LYP2和CM-LYP2的体外免疫调节活性，从脾脏增殖能力、巨噬细胞吞噬能力、NO和细胞因子分泌功能等方面进行了体外实验，综合评价Ac-LYP2和CM-LYP2对免疫功能的调节作用。 结果：1.水提醇沉法提取的龙眼肉多糖得率为7.22%，龙眼肉粗多糖中的糖含量达到67.85%；木瓜蛋白酶法测定的蛋白清除率为71.58%；从0.125 mol/L NaCl流分中得到均一多糖组分LYP2。2.龙眼肉多糖乙酰化最佳合成工艺为：乙酸酐：LYP2=10.2:1，反应温度42℃，反应时间30 min。该反应条件下合成的乙酰化龙眼肉多糖的DS达到0.443。3.对LYP2进行羧甲基化修饰的最佳制备工艺为：MCA浓度1.2 mol/L，反应温度73℃，反应时间3.2 h。根据该制备工艺得到的羧甲基化龙眼肉多糖的DS约为1.053。4. LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2均具有不同程度的清除自由基能力、抑制脂质过氧化能力及对过氧化氢损伤细胞的保护能力。LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2清除羟基自由基的半数清除浓度（EC50）分别为5507.67μg/mL（4.67×10-5 mol/L）、702.41μg/mL（5.45×10-6 mol/L）和519.39μg/mL（3.44×10-6 mol/L）；LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2清除超氧阴离子自由基的EC50分别为2219.05μg/mL（1.88×10-5 mol/L）、977.12μg/mL（7.57×10-6 mol/L）和489.70μg/mL（3.24×10-6 mol/L）；LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2抑制小鼠肝脏脂质过氧化的半数抑制浓度（IC50）分别为917.99μg/mL（7.78×10-6 mol/L）、646.04μg/mL（5.01×10-6 mol/L）和544.21μg/mL（3.60×10-6 mol/L）；LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2抑制H2O2诱导的红细胞溶血的IC50分别为620.82μg/mL（5.26×10-6 mol/L）、380.11μg/mL（2.95×10-6 mol/L）和262.76μg/mL（1.74×10-6 mol/L）；5.在20~160 mg/kg范围内，LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2均能在一定程度上提高免疫抑制小鼠的脾脏指数，显著提高免疫抑制小鼠耳肿胀度、同时显著升高半数溶血值（HC50）、血清中IL-4含量和溶菌酶含量，降低血清中IFN-γ含量，并且相同浓度下，Ac-LYP2和CM-LYP2表现出的免疫效应更强。6.三个多糖组分协同脂多糖（LPS）促进B淋巴细胞增殖的强弱顺序为：CM-LYP2> LYP2> Ac-LYP2，而协同刀豆蛋白（Con A）促进T淋巴细胞增殖的强弱顺序为：Ac-LYP2> LYP2> CM-LYP2。LYP2、Ac-LYP2和CM-LYP2均能协同LPS显著地增强巨噬细胞的吞噬能力，且表现出一定的量效关系。其活性强弱顺序依次为：Ac-LYP2> CM-LYP2>LYP2。LYP2、Ac-LYP2和CM-LYP2可以促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-12p40。 结论：1.乙酸酐法优选的乙酰化龙眼肉多糖合成工艺稳定可行，是一种合成多糖乙酰化衍生物比较理想的方法。2.采用氢氧化钠-MCA体系制备多糖羧甲基衍生物简单易行、稳定可控，是一种比较理想的化学修饰方法。3.乙酰基和羧甲基的引入有利于提高龙眼肉多糖的抗氧化能力，从质量浓度角度考虑，Ac-LYP2和CM-LYP2的抗氧化能力弱于维生素C，若从物质的量浓度考虑，维生素C的抗氧化能力不及Ac-LYP2和CM-LYP2。4. LYP2、Ac-LYP2和CM-LYP2能够不同程度地增强免疫抑制小鼠的特异性免疫功能和非特异性免疫功能，改善Th1/Th2平衡紊乱，乙酰基和羧甲基的引入有利于提高龙眼肉多糖的免疫调节活性。5、LYP2、Ac-LYP2和CM-LYP2在体外不仅能协同LPS或Con A促进小鼠脾淋巴细胞增殖，而且能活化巨噬细胞，促其释放免疫活性分子NO和IL-1β、TNF-α、IL-12p40，增强其吞噬中性红的能力。
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