摘要
抑郁症是一种慢性情感障碍性疾病，患者反复持续心境低落、情绪消极，易激发自杀倾向。据世界卫生组织预测，到2020年抑郁症将成为人类的第二大疾病。但现有的三环类、选择性五羟色胺/去甲上腺素再摄取抑制剂、单胺氧化酶抑制剂等抗抑郁药物疗效并不理想，因此针对抑郁症的发病机制和发现新的抗抑郁药物治疗靶点是目前研究的热点之一。近来有研究提示中脑腹侧被盖区（VTA）多巴胺（DA）系统在动物抑郁样行为中发挥了关键作用。最近的研究发现，慢性社交挫败（social defeat）压力所诱发的小鼠V TA区DA能神经元放电活动增加，是引发抑郁样行为的关键因素，因此理解控制VTA区DA能神经元电活动的电生理机制十分重要。 VTA区DA能神经元以低频的单放电和簇放电模式自发地产生动作电位。簇放电导致大量多巴胺释放，更高效地调节VTA及投射区域神经元的活动。在反复社交挫败压力刺激下，DA能神经元的簇放电活动增加，与此相关，社交挫败刺激也可导致V TA区DA能神经元某些钾通道的表达发生改变，而增加钾通道的表达会完全消除小鼠的抑郁症状。另有研究发现敲除TREK1钾通道可以抑制抑郁样行为的出现；选择性阻断TREK1通道也可以产生快速抗抑郁作用。因此，通过调节钾通道而影响VTA区DA能神经元兴奋性可能为一种有效的治疗方法。 Kv7/KCNQ通道广泛分布于神经系统，是一种以慢激活、慢去活、非失活为特征的电压依赖性钾通道，在控制神经元的兴奋性中发挥重要作用。Kv7通道家族主要包括 Kv7.1~7.5五种亚型。在腹侧中脑， Kv7.2~Kv7.5表达最为广泛，而Kv7.4则局限高表达在VTA和黑质（SNc） DA能神经元中。有研究提示Kv7通道可以作为与中枢神经系统兴奋性异常有关疾病的治疗靶点，如癫痫、疼痛、焦虑和药物成瘾等。本论文的第一部分和第二部分将对Kv7.4通道调节VTA区DA能神经元兴奋性的机制展开研究，并探讨 Kv7.4通道与社交挫败压力刺激引发抑郁行为的关系。我们将利用新近发现的选择性Kv7.4开放剂fasudil（法舒地尔）和Kv7.4基因敲除小鼠进行上述研究。 除Kv7.4钾通道外，之前研究提示其他钾通道也可能参与了VTA区DA能神经元兴奋性的调控，例如GIRK、A型钾通道、Ca2+激活钾通道（SK通道）等。本论文的第三部分将研究这些钾离子通道在VTA区DA能神经元的表达，以及对兴奋性的调节，重点观察A型钾通道对DA能神经元放电频率和放电模式的影响。 第一部分 Kv7.4通道在VTA区DA能神经元兴奋性调节中的作用 目的：了解Kv7.4钾通道在调控VTA区DA能神经元兴奋性中的作用。 方法：（1）利用免疫组化和全细胞及贴附式膜片钳技术，确定小鼠VTA区DA能神经元中Kv7.4通道的表达分布及电生理特性；并观察Kv7通道调节剂对VTA区DA能神经元的Kv7/M电流、静息膜电位、诱发放电和自发放电的影响。（2）利用免疫荧光成像技术，观察 Kv7.4通道在V TA区DA能神经元上的表达。 结果：（1）小鼠VTA区DA能神经元电生理特征鉴定：-300 pA的超极化电流诱发“sag”内向整流特性电位，电位平均幅度为60.2±3.7 mV（野生小鼠）。自发性动作电位时程从开始至波谷的时间间隔为2.6±0.1 ms，从开始至电位恢复到正常水平的时间间隔为5.5±0.2 ms；平均放电频率分别为1.3±0.1 Hz。（2）免疫荧光结果显示Kv7.4通道高表达在VTA外侧和部分黑质致密部的TH免疫阳性神经元中；Kv7.4基因敲除小鼠（Kv7.4-/-）中未见 Kv7.4表达。非选择性 Kv7通道开放剂RTG可浓度依赖性地增加VTA区DA能神经元的Kv7/M样电流，EC50为3.4±0.3μ M；10μ M RTG使Kv7/M样电流从45.6±9.1 pA增大至80.2±14.1 pA（P<0.01）；Kv7阻断剂XE911（3μ M）使Kv7/M样电流从59.1±6.4 pA降低至26.0±3.1 pA（P<0.01），抑制率为45.6±6.0%；在Kv7.4-/-小鼠中，RTG的作用消失，XE991仅抑制了剩余电流的11.8±4.3%。（3）在稳定表达Kv7.4钾通道的CHO细胞和脑片VTA区DA能神经元中，法舒地尔（fasudil）（0.1,1,10,30,100μ M）选择性浓度依赖地增加Kv7.4电流，EC50分别为14.2±0.6μ M和16.8±1.1μ M，应用3μ M XE991可逆转上述作用；在Kv7.4-/-小鼠中，法舒地尔无上述作用；法舒地尔不激活 Kv7.2及 Kv7.2/Kv7.3通道。（4）在野生型小鼠的VTA区DA能神经元中，3μ M XE991和10μ M法舒地尔分别使神经元膜电位从-65.3±3.1 mV和-66.6±3.6 mV改变至-62.9±3.0 mV和-72.4±4.0 mV（P<0.01，P<0.001）；Kv7.4-/-小鼠中未见上述作用。（5）10μ M法舒地尔明显降低去极化电流诱发的VTA区DA能神经元动作电位的爆发次数，而在Kv7.4-/-小鼠中，10μ M法舒地尔对诱发的放电无显著影响；200 pA去极化电流在野生型和Kv7.4-/-小鼠VTA区DA能神经元中分别诱发13.0±1.7和21.6±2.9个动作电位（P<0.05）。（6）在全细胞和“松弛”细胞贴附式记录模式下，法舒地尔分别使自发放电频率由1.5±0.3 Hz和1.7±0.3 Hz降低至0.6±0.2 Hz和0.8±0.3 Hz（P<0.05，P<0.01）；法舒地尔在Kv7.4-/-小鼠中无上述作用。野生型与Kv7.4-/-小鼠的VTA区DA能神经元的平均放电频率分别为1.7±0.3 Hz和3.6±0.6 Hz，二者具有显著性差异（P<0.05）。 结论：（1）Kv7.4高度表达于VTA边侧和部分黑质致密部的TH免疫阳性神经元中。（2）法舒地尔选择性激活Kv7.4通道；Kv7.4是构成VTA区DA能神经元中Kv7/M电流的主要Kv7亚型。（3）法舒地尔使VTA区 DA能神经元的膜电位超极化，抑制诱发的放电和自发放电；法舒地尔的上述作用由Kv7.4介导。选择性激活Kv7.4通道对VTA区DA能神经元的兴奋性具有显著的抑制作用。 第二部分 Kv7.4通道在多巴胺调节VTA区DA能神经元兴奋性中的作用及与动物抑郁样行为的关系 目的：研究Kv7.4通道参与多巴胺调节VTA区DA能神经元自发放电的过程及信号转导机制，并观察Kv7.4通道与动物抑郁样行为的关系。 方法：利用离体脑片全细胞、贴附式膜片钳技术和 Kv7.4基因敲除小鼠，观察Kv7.4通道在多巴胺增大VTA区DA能神经元Kv7/M电流以及抑制兴奋性中的作用；建立小鼠慢性社交失败抑郁症模型，利用上述电生理技术，观察抑郁模型小鼠VTA区DA能神经元上Kv7.4钾通道对放电活动的影响。 结果：（1）在野生型小鼠中，20μ M和100μ M多巴胺分别使VTA区 DA能神经元 Kv7/M电流增大42%和53%，这一作用可被3μ M XE991逆转；在 Kv7.4-/-小鼠，100μ M多巴胺仅使 Kv7/M电流增加14%（。2）20μ M多巴胺使膜电位从-65.3±2.9 mV超极化至-75.9±2.1 mV（P<0.01），这一作用可被3μ M XE991逆转。多巴胺使野生型（提前给予3μ M XE991）和Kv7.4-/-小鼠VTA区DA能神经元的静息膜电位分别改变2.5±2.0 mV和2.9±1.2 mV，二者无显著性差异（P>0.05）。（3）多巴胺使野生型和Kv7.4-/-小鼠VTA区DA能神经元的平均放电频率由1.9±0.3 Hz和2.5±0.3 Hz降低至0.6±0.2 Hz和1.7±0.4 Hz（P<0.01，P<0.05），抑制率分别为62.1±11.3%和39.1±10.3%（P<0.001）。（4）VTA区DA能神经元对XE991有不同反应，依此分为两类：Kv7依赖的神经元（73%）和非Kv7依赖的神经元（27%）。在Kv7依赖的神经元中，XE991阻断了多巴胺降低放电频率的作用，而在非Kv7依赖的神经元中XE991无此作用（。5）D2受体阻断剂sulpiride（300 nM）、Gi/o蛋白阻断剂pertusistoxin（PTX，500 ng/ml）和还原剂dithiothreitol（DTT，1 mM）可以抑制多巴胺增大Kv7/M样电流的作用，而D1受体阻断剂SCH23390（1μM）无上述作用；D2受体阻断剂sulpiride还抑制多巴胺引起的膜电位超极化和抑制放电作用。（6）与对照组和非敏感型小鼠相比，对社交挫败刺激敏感小鼠的VTA区DA能神经元上XE991敏感的Kv7/M电流幅度明显降低。（7）多巴胺显著降低正常小鼠V TA区DA能神经元放电频率，而在社交挫败敏感型小鼠的V TA区DA能神经元上，上述作用消失。在正常和敏感型小鼠中，法舒地尔降低VTA区DA能神经元放电，抑制率分别为42.2±13.5%和31.6±12.2%（P>0.05）。 结论：（1）Kv7.4通道参与调控多巴胺抑制VTA区DA能神经元自发放电的过程，这一作用依赖于多巴胺D2受体和Gi/o蛋白，并与氧化还原机制有关。（2）在VTA区域，73%DA能神经元为Kv7依赖神经元，多巴胺通过Kv7.4通道调节VTA区DA能神经元自发放电；27%非Kv7依赖神经元则通过其他机制调节神经元放电。（3）在社交挫败抑郁模型小鼠中，VTA区DA能神经元上Kv7.4通道功能明显降低。（4）多巴胺不能抑制社交挫败敏感型小鼠V TA区DA能神经元的自发发电；法舒地尔可降低正常和社交挫败敏感型小鼠V TA区DA能神经元的自发放电。 第三部分 A型钾通道对VTA区DA能神经元兴奋性的调节及生理意义 目的：比较A型钾通道和Kv7通道、SK通道及GIRK通道对VTA区DA能神经元兴奋性的作用特点，并观察A型钾通道对谷氨酸受体介导的电活动的影响， 方法：本实验应用全细胞膜片钳技术、贴附式膜片钳技术和行为学检测，观察A型钾通道对V TA区DA能神经元静息膜电位和自发放电频率的调节，以及A型钾通道调节电活动的作用与谷氨酸受体之间的关系。 结果：（1）与对照组小鼠相比，社交挫败非敏感型小鼠的瞬时外向电流显著上调（P<0.05）；敏感小鼠的瞬时外向电流也略有增加，但无统计学意义（P>0.05）。（2）免疫荧光结果显示，Kv7.4集中分布在VTA外侧和部分黑质致密部；SK3通道集中高表达在 VTA近中线部；Kv7.2阳性神经元分布于黑质致密部和 VTA外侧及网状部；Kv4.3通道广泛分布在VTA和黑质；Kv7.5则弥散分布在VTA和包括网状部在内的整个黑质；所有SK3和Kv4.3与TH共定位，Kv7.2和Kv7.5与TH部分共定位。（3）在VTA区DA能神经元上，A型钾通道阻断剂4-AP（2 mM）、Kv7/M通道阻断剂XE991（3μ M）、GIRK通道阻断剂tertiapin（50 nM）和钙激活钾通道 SK3阻断剂 apamin（10 nM）分别使静息膜电位由-61.3±3.0、-65.3±3.0 mV、-62.3±6.1 mV、-60.2±4.2 mV去极化至-55.9±2.6 mV（P<0.001）、-62.9±3.0（P<0.01）、-58.9±6.1 mV（P<0.001）、-56.5±5.4 mV（P<0.05）；分别改变5.8±1.0 mV、2.4±0.7 mV、3.5±0.3 mV、0.93±0.04 mV，XE991、tertiapin、apamin分别与4-AP相比，均具有显著性差异（P<0.05，P<0.05，P<0.001）。（4）4-AP、XE991、tertiapin、apamin使VTA区DA能神经元的放电频率由1.8±0.2 Hz、1.9±0.3 Hz、1.6±0.2 Hz、1.3±0.3 Hz增加至2.8±0.3 Hz（P<0.01）、2.1±0.3 Hz（P>0.05）、1.8±0.2 Hz（P<0.05）、1.6±0.3 Hz（P>0.05）；增加率分别为65.8±14.1%、13.9±5.5%、16.9±5.9%、41.7±23.2%，XE991、tertiapin分别与4-AP相比，均具有显著性差异（P<0.01，P<0.01）。（5）在NMDA（20μ M）作用下，4-AP使神经元平均放电频率由1.7±0.3 Hz增加至2.1±0.4 Hz（P<0.05）；在 picrotoxin（GABAA受体阻断剂，100μ M）+kynurenic acid（离子型谷氨酸受体阻断剂，100μ M）作用下，4-AP没能改变放电频率（由2.0±0.4 Hz变为3.3±1.3 Hz，P>0.05）；在picrotoxin+CNQX（AMPA/kainate谷氨酸受体阻断剂，12.5μ M）+NMDA作用下，4-AP使放电频率由4.0±0.8 Hz增加至5.0±1.1 Hz（P<0.05）。（6）在NMDA（20μ M）作用下，4-AP使动作电位峰峰间期变异系数（CV-ISI）由0.4±0.08增加至0.6±0.1（P<0.05）；在Picrotoxin（100μ M）+kynurenic acid（100μ M）作用下，4-AP没有影响CV-ISI（由0.5±0.1变为0.5±0.06，P>0.05）；在Picrotoxin（100μ M）+ CNQX（12.5μ M）+ NMDA作用下，4-AP使CV-ISI由0.6±0.1增加至0.8±0.3（P<0.05）。 结论：（1）Kv4.3通道广泛表达在VTA与黑质，与TH免疫阳性（多巴胺）神经元共定位；（2）静息状态下，A型钾通道调节VTA区DA能神经元静息膜电位和自发放电频率；阻断NMDA受体可能会抑制A型钾通道调节自发放电的作用；而当NMDA受体激活时，A型钾通道可干扰神经元放电的规律性。
NETL