摘要
目的：炎症反应是宿主抵抗病原体的一个重要反应途径，然而，当炎症过度活化或失去调节时，将导致宿主的组织损伤。大量实验证实：过度活化的炎性细胞因子介导的固有免疫和适应性免疫能够导致人类脓毒血症以及免疫功能障碍的发生。在临床中，念珠菌血症具有一些同细菌性脓毒血症相似的症状。早期大部分表现为中高热、低血压、心率增快以及酸中毒等症状，而晚期一些患者常发展为感染性休克以及多器官功能障碍。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族在炎症和应激中是信号转导重要的组成部分，能够调控一系列的生理过程。MAPK家族包括p38,JNK,和ERK,并通过磷酸化激活。有研究显示,在细菌性脓毒血症中p-p38,p-ERK,p-JNK的表达显著增加，而MAPK的磷酸化可导致器官的损伤。此外，p38的激活能够调节巨噬细胞和T细胞对创伤性损伤的反应。热休克蛋白是一组分子伴侣蛋白，当细胞遭受高温或者其他外界刺激时，能够维持客户蛋白的稳定性，防止未折叠蛋白降解。HSP90做为重要的分子伴侣之一，负责客户蛋白的三级折叠，如IKK,IRAK-1和MAP激酶，并通过TLR信号途径参与固有免疫反应。在体外实验中，HSP90抑制剂能够减轻脂多糖（LPS）诱导的大鼠脓毒血症中的炎症反应，延长大鼠的生存期。在LPS体外刺激小鼠巨噬细胞的实验中，HSP90抑制剂能够通过降低p38的磷酸化水平以及介导巨噬细胞的凋亡而发挥抗炎作用。而HSP90抑制剂对由白念珠菌引起的炎症反应未见报道。本实验通过白念珠菌体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞，探讨 HSP90抑制剂是否通过抑制巨噬细胞的增殖及降低p38磷酸化水平而发挥抗炎作用。 方法： 1.实验用小鼠 健康的雌性昆明种小鼠35只，清洁级，4-5周龄,18～23g,由河北医科大学实验动物中心提供,合格证编号：1508052。 2.实验用菌株 白念珠菌标准株ATCC90028购于中国医学科学院微生物研究所。 3.菌株的活化、菌悬液的配制及灭活 白念珠菌标准株复温后在沙氏培养基上传代三次，加入含0.1%吐温80的1640培养液，吸管轻轻吹打混匀，血球计数板计数，调整终浓度为1-2×106/mL。随后将装有白念珠菌的试管放入65℃水浴锅中加热30min进行灭活。 4.巨噬细胞分离培养及鉴定 采用小鼠腹腔巨噬细胞分离法提取巨噬细胞，1640培养液（含10%胎牛血清）进行培养，巨噬细胞培养3天后取出。 采用形态学及免疫组织化学法进行巨噬细胞的鉴定：将巨噬细胞制成单细胞悬液后，进行细胞爬片，第2天后，取出盖玻片，丙酮固定，进行HE染色及免疫组织化学SP法检测巨噬细胞CD68抗原的表达，中性树胶封固。 5.实验分组与处理 实验分为实验组和对照组。巨噬细胞培养3天后取出，离心洗涤后计数板计数。并用含10%胎牛血清1640培养液调整终浓度至5-6×105/mL，转种至6孔板中，每孔2mL，培养8-10小时后每孔加入浓度为2×106/mL菌悬液0.5mL。 实验组每孔分别加入终浓度为0.01μmol/L～1μmol/L的17-DMAG100μL，对照组则加入同体积含10%胎牛血清1640培养液。于第12小时分别收集实验组及对照组细胞，-80℃冻存待测。每组均设置4个重复孔。 6.Western blot法检测各组细胞磷酸化p38蛋白的表达水平 实验各组巨噬细胞从六孔板吹打下来后离心，PBS洗涤2遍，用含蛋白磷酸酶抑制剂的细胞裂解液RIPA将上述细胞裂解，提取总蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳，随后转至 PVDF膜，牛奶蛋白封闭后，分别孵育p-p38(1：300)与β-actin(1：1000)一抗及抗兔IgG二抗(1：3000)，最后用双色红外激光扫描仪进行扫膜，Image J软件分析结果。 7.CCK-8法检测各组细胞增殖率的变化 将100μL浓度为5-6×105/mL的细胞悬液接种至96孔培养板内，放置细胞培养箱8h后，分别加入90μL浓度为5.5-6.5×105/mL菌悬液及10μL终浓度为0.01μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L的HSP90抑制剂孵育12h。同时设对照组（不加药物组）和空白组（只加培养液和白念珠菌悬液），孵育12h后，每孔加入20μL的CCK-8溶液，继续放置细胞培养箱内，3h后用酶标仪测定各孔在450nm波长的A值。按照公式：增殖抑制率（ PI）=[A(对照组)－A(实验组)]／[A(对照组)－A(空白组)]×100%。计算细胞增殖抑制率。每组均设置3个重复孔。 8.巨噬细胞增殖与p-p38表达的相关分析 用Spearman相关分析法将上述计算的细胞增殖抑制率与p-p38的表达水平进行相关分析 9.统计学分析 用SPSS13.0统计软件，数据结果以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-K检验，P<0.05为有统计学意义。 结果 1.巨噬细胞形态观察 培养第1天后，倒置显微镜下可观察到巨噬细胞为圆形和椭圆形，贴壁生长。培养第3天后，倒置显微镜下可见巨噬细胞体积增大，多为梭形，多角形，部分为圆形，椭圆形，形成伪足或突起，贴壁生长。 2.巨噬细胞的鉴定 HE染色可观察到巨噬细胞胞浆丰富，呈粉红色；胞核大而深蓝，呈卵圆形，肾形或不规则形，偏居于细胞的一侧。巨噬细胞免疫组织化学结果CD68阳性反应位于巨噬细胞的胞膜及胞浆。 3.Western blot法检测各组细胞磷酸化p38蛋白的表达水平 在实验组中，17-DMAG的终浓度分别为0.01μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L，相对应磷酸化的 p38的表达水平分别为1.108±0.122、0.699±0.054、0.621±0.095、0.397±0.043，与对照组（未加HSP90抑制剂）1.383±0.042相比，17-DMAG能够降低由白念珠菌刺激巨噬细胞p-p38的表达水平，具有统计学意义（P<0.05）。并且随着抑制剂浓度的逐渐增加，p-p38的表达水平逐渐减少，具有统计学意义（P<0.05）。 但抑制剂的浓度在0.1?mol/L和0.5?mol/L时，对p-p38的表达是没有差别的（P>0.05）。 4.17-DMAG抑制由白念珠菌刺激巨噬细胞增殖的结果 CCK-8结果显示，17-DMAG的终浓度分别为0.01μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L，作用12h后，抑制率分别为(43.33±10.06)%，(55.60±10.09)%，(56.33±7.14)%，(77.33±6.65)%。17-DMAG的浓度在1μmol/L时，其抑制巨噬细胞增殖作用高于其他三组(P<0.05)。但是，在0.01μmol/L、0.1μmol/L、和0.5μmol/L之间，其抑制巨噬细胞增殖作用无明显差别(P>0.05)。因此，在一定浓度范围内，随着抑制剂浓度的逐渐增加，其抑制巨噬细胞增殖的作用逐渐增强。 5.巨噬细胞的抑制增殖率与p-p38的表达水平的相关分析结果 通过Spearman相关分析，在17-DMAG各浓度抑制剂的作用下，巨噬细胞的增殖抑制率与p-p38表达水平呈负相关，r=-0.719（P<0.01）。 结论： 1.白念珠菌体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞,17-DMAG能够抑制巨噬细胞磷酸化p38的蛋白表达。并且随着抑制剂浓度的增高，抑制巨噬细胞表达磷酸化p38的作用逐渐增强，在一定范围内，呈浓度依赖性。 2.白念珠菌体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞,17-DMAG能够抑制由白念珠菌刺激巨噬细胞的增殖，在一定范围内，呈浓度依赖性。 3.在17-DMAG的作用下，巨噬细胞的增殖抑制率与p-p38表达水平呈负相关。 综上结果表明：白念珠菌体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞，HSP90抑制剂可能通过抑制巨噬细胞的增殖而降低p-p38蛋白的表达水平，从而发挥抗炎作用的。
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