摘要
体细胞核移植（SCNT）即以去核卵母细胞为核受体，将核供体细胞通过特殊人工手段移植入其中，获得核移胚后经体外发育成完整个体的一种方法。为达到进一步建立和优化体细胞核移植体系的目的，本实验分别对核供体细胞、卵母细胞体外成熟体系、胚胎激活及培养体系进行了优化，采用优化后的体系制备绵羊体细胞核移胚，对其体外发育率进行了检测。具体研究内容及结果如下： （1）体外培养绵羊皮肤成纤维细胞（SSFs），培养液中添加不同浓度胎牛血清（FBS），测定其生长曲线；对体外培养的SSFs进行血清饥饿，采用噻唑蓝比色（MTT）法测定其增殖抑制率；采用三种方法（100%汇合、血清饥饿及100%汇合+血清饥饿）预处理体外培养的SSFs，采用流式细胞技术测定处于不同细胞周期的细胞比例。结果表明，本实验室冻存的SSFs形态良好；添加10% FBS的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培养液适合SSFs的体外生长；SSFs的增殖抑制率随血清饥饿处理时间延长而升高，处理6 d后达到21.1%；100%汇合+血清饥饿法处理适合诱导 SSFs进入 G0/G1期，处理后处于该周期细胞占总细胞数的71.24%。 （2）对绵羊卵母细胞的体外成熟体系进行了优化，包括：卵母细胞的采集方法、体外成熟培养方法、培养液中促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）、表皮生长因子（EGF）及胰岛素转铁硒钠（ITS）的添加浓度。结果表明，与抽吸法相比，切剖法更适合绵羊卵母细胞的采集，每枚卵巢可采集2.35枚卵母细胞；微滴法与凹皿法的体外成熟率分别为54.58%及56.54%，两者之间差异不显著；在绵羊卵母细胞体外成熟液中添加0.9 IU/mL的FSH及LH，50 ng/mL的EGF，1%（v/v）的ITS可使绵羊卵母细胞体外成熟率达到80.37%。 （3）对绵羊卵母细胞的激活体系及胚胎体外培养体系进行了优化，包括：孤雌激活过程中6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）的处理时间、孤雌胚体外培养液中必需氨基酸（EAA）的添加浓度。结果表明，6-DMAP处理4 h，能有效激活卵母细胞，孤雌胚的体外卵裂率及桑椹胚率分别达70.75%及33.96%；SOFaa液中添2%（v/v）EAA适合孤雌胚的体外发育，卵裂率及桑椹胚率分别达73.45%及36.28%；凹皿法与微滴法培养的孤雌胚体外卵裂率分别为72.5%及73.56%，桑椹胚率分别为35.83%及36.91%，两者之间差异不显著。 （4）采用上述优化体系进行绵羊体细胞核移植操作，采用机械去核、卵胞质内注核、化学激活法构建绵羊体细胞核移胚，经体外培养，卵裂率及囊胚率分别达45.26%及13.95%。
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