摘要
目的：本论文分为两大部分，第一部分从基础细胞实验层面研究肺腺癌A549细胞中EGFR表达量与自噬活性的关系；第二部分从临床实验角度研究，肺腺癌患者胸水中癌细胞EGFR突变状态与自噬活性是否相关。下面分别阐述： (一)研究显示肺癌为全世界范围内发病率和死亡率极高的癌症，通过特异性RNA干扰介导技术降低表皮生长因子受体EGFR的表达，来探究EGFR对肺腺癌A549细胞的自噬活性的影响，为肺癌实验及临床研究提供新的思路。 (二)随着对肺癌发生、发展中分子生物学机制、诊断和预后以及肺癌中癌基因突变的深入研究，目前辅助EGFR靶向治疗的新型诊断方法已成为现阶段研究的热点，在此我们运用Real Time RT-PCR方法检测肺腺癌患者胸水细胞，比较EGFR突变组与非突变组的自噬相关基因LC3和Beclin1的表达是否有差异，探索自噬活性与EGFR突变状态是否相关，为临床及实验研究提供新的思路和突破点。 方法： (一) 1应用基因转染技术，将EGFR特异性干扰RNA转染入肺腺癌A549细胞中，应用Real Time RT-PCR(real time reverse transcription polymerase chain reaction)、Western-Blot方法检测外源性EGFR特异性干扰RNA(EGFR siRNA)介导的表皮生长因子EGFR转录后的基因沉默效应。 2选取处于对数生长期的肺腺癌A549细胞，将其接种于六孔板内，本实验可分为四组：转染EGFR siRNA组、转染negative control siRNA组、转染试剂组和正常组。经siRNA转染后，分组细胞皆经适量浓度EGF处理半个小时后，应用Westrn-Blot方法检测EGFR siRNA转录A549细胞前后自噬效应分子LC3蛋白表达水平的变化，并分析其与表皮生长因子受体EGFR之间相互作用的关系。 3用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy, TEM)对比观察转染EGFR特异性干扰RNA(EGFR siRNA)组和阴性对照组siRNA(control siRNA)组自噬小体的变化，判断细胞内自噬情况。 (二)收集河北医科大学第四医院癌检中心2015年9月至2015年12月初诊疑似肺癌患者胸水。 1苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE染色法)对患者胸水细胞涂片进行诊断筛查。 2免疫细胞化学法(Immunochemistry,ICC)进一步诊断细胞涂片上癌细胞的类型。 3 ARMS(amplification refractory mutation system)实时定量荧光PCR法扩增癌细胞检测EGFR基因是否突变，进而把患者分为EGFR突变组与EGFR非突变组。 4 Real Time RT-PCR方法检测胸水中癌细胞中自噬效应分子LC3和Beclin1的mRNA水平，运用统计学方法比较EGFR基因突变组与EGFR非突变组自噬效应分子LC3与Beclin1是否有差异性。 结果： (一) 1 Western-Blot实验结果显示，在转染EGFR特异性干扰RNA的A549细胞中，转染 EGFR特异性 siRNA(1,3)后，表皮生长因子EGFR的蛋白水平上表达量均有明显降低，具有统计学差异(P＜0.05)，其表达下降量最为明显的是EGFR siRNA-1。Real Time RT-PCR实验结果显示转染EGFR siRNA-1后，EGFR的mRNA表达量显著下降具有统计学差异(P＜0.05)。 2 EGFR特异性 siRNA（EGFR siRNA）沉默表皮生长因子EGFR后， Western-Blot结果表明在蛋白表达水平自噬特异性效应物 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增加。 3透射电子显微镜对比观察转染EGFR特异性siRNA（EGFR siRNA）组和阴性对照 siRNA（control siRNA）组，结果显示EGFRsiRNA组细胞中形成较多大量双层膜包裹未被完全降解的细胞内容物的自噬小体。 (二) 1 HE常规染色涂片分别经两位细胞病理学医生初诊，均可见丰富的恶性肿瘤细胞，细胞呈多形型，细胞核增大，染色质粗糙，核浆比增大，即可满足进一步免疫细胞化学染色与ARMS法检测的需要。 2免疫细胞化学染色法中，肺腺癌特异性标记抗体TTF-1及NapsinA等在细胞学涂片中都表现为阳性，即通过免疫细胞化学染色进一步诊断患者胸水属于肺腺癌。 3 ARMS法检测恶性胸水共计40例，其中检测出EGFR非突变组15例,突变组25例。 4 Real Time RT-PCR检测突变组与非突变组中的自噬相关蛋白LC3在统计学上有显著差异性，而Beclin1在统计学上无显著差异性。 结论： 1特异性EGFR siRNA可有效发挥EGFR转录后基因沉默效应(PTGs， post-transcriptional gene silencing)。 2应用特异性EGFR siRNA沉默表皮生长因子EGFR表达后，可提高人肺腺癌A549细胞自噬活性，说明EGFR的表达量与细胞自噬活性呈负相关性。 3肺腺癌胸水细胞在EGFR突变与非突变状态下的自噬活性有差异，非突变状态下自噬活性高于突变状态。 4两部分研究表明，肺腺癌细胞自噬活性不仅与EGFR的表达量有关，还与EGFR点突变状态相关，为临床肺腺癌研究与(靶向)治疗提供新的思路与突破点。
NETL