摘要
随着环境的改变、药物的使用、肿瘤发病率的增加、老年患者肾活检量增加，肾炎病理疾病谱发生了巨大变化。膜性肾病(membranous nephropathy, MN)在肾炎肾活检中所占的比率也逐年升高，根据上海交通大学附属瑞金医院统计从2000年的7.1％升至2009年的22.7％。王海燕教授研究表明，在总人群中，膜性肾病已经成为继IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)之后的第二大病理类型。在大于60岁的老年人群中，膜性肾病是最常见的病理类型。在过去的半个世纪中，肾脏病学家在膜性肾病发病机制方面做了许多努力，包括成功制造Heymann's膜性肾病动物模型以及发现中性肽链内切酶(NEP)参与儿童膜性肾病发病等。2009年，Beck等人在大约70％特发性膜性肾病患者血清中发现抗M-型磷脂酶A2受体(PLA2R1)抗体，提出该抗原是特发性膜性肾病(Idiopathic membranousnephropathy, IMN)的主要靶抗原。随后PLA2R1受到了越来越多肾脏病学家的关注。我国人群基因、饮食习惯、环境均异于国外，并且关于我国IMN肾组织PLA2R1抗原的研究鲜有报道。 在我国，IgA肾病占原发性肾小球疾病的45％～50％，是我国人群中最常见的肾小球肾炎，同时也是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病。血清IgA/C3比值作为一个简单的检测指标，在IgA肾病诊断中价值尚未形成定论。并且关于血清IgA/C3比值与IgAN的病理间的关系研究较少。 目的： 1.检测我国IMN患者肾组织PLA2R1抗原的表达，探讨其肾组织PLA2R1抗原表达与血清该抗体表达阳性率的差异。 2.评价血清IgA/C3比值在IgAN诊断预测中的价值及其与IgAN病理之间的关系。 方法： 1.成人特发性膜性肾病患者肾组织PLA2R1抗原及血清抗PLA2R1抗体的检测 1.1 研究对象 选取2010年5月至2014年5月于南方医科大学第三附属医院肾内科行肾活检证实的成人IMN、其他肾小球疾病及继发性膜性肾病患者共114例，包括IMN41例、乙型肝炎病毒相关性膜性肾病(HBV-MN)8例、Ⅴ型狼疮肾炎(LN)8例、IgA肾病27例、微小病变性肾病(MCD)19例、轻度系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)5例、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)6例。IMN的诊断是根据肾活检病理诊断为膜性肾病，经详细的询问病史及相关实验室检查排除由系统性红斑狼疮、乙型肝炎病毒、肿瘤等继发性膜性肾病。本研究所纳入的病例临床上均未长期使用免疫抑制剂或（和）糖皮质激素治疗，所有肾活检均经患者知情同意。 1.2 标本采集及方法 B超声引导下行肾活检穿刺，常规行光镜、免疫荧光和电镜检测。采用直接免疫荧光法对新鲜冰冻组织常规进行IgA、IgM、IgG、C3、C4、C1q染色。对石蜡组织行HE染色、PAS染色、PASM染色、MASSON染色。我们使用石蜡包埋组织组织采用间接免疫荧光法，检测IMN、继发性膜性肾病及其他肾小球疾病肾组织PLA2R1抗原。 收集血清标本:留取肾活检当日清晨空腹静脉血，所有标本均采血5ml，置于促凝剂试管中，凝固后使用离心机离心8min，转速为3000r/min，分离血清，冻存于-80℃冰箱待检。检测IMN患者血清抗PLA2R1抗体。 1.21 肾组织PLA2R1抗原的检测 材料:兔抗人PLA2R1多克隆抗体(Sigma，HPA012657)，FITC标记抗兔IgG二抗(CW0114)，BSA固体粉末（Sigma公司）。 石蜡切片:经烤片;脱蜡;1∶20蛋白酶K消化30min; PBS冲洗;5％BSA室温下封闭（勿冲洗）;加一抗（兔抗人PLA2R1多克隆抗体），37℃孵育1.5小时;PBS冲洗3次，甩干后加二抗（鼠抗兔IgG CWIBO）;孵育1小时左右，PBS冲洗3次，封片;-20℃避光保存。荧光显微镜下观察，奥林巴斯激光扫描共聚焦显微镜下拍摄。 根据荧光强度划分为阴性、±、+、++、+++、++++。 阴性对照:对每种疾病均使用PBS替代一抗做对照，只有加PBS阴性并且加一抗阳性者，才判断为阳性。 1.22 间接免疫荧光法检测IMN患者血清抗PLA2R1抗体 遵照欧盟检测试剂盒Phospholipase A2 receptor1(PLA2R1) IgG(FA1254-1005-50 IgG)试剂说明书进行样本稀释、加样、温育、冲洗、加荧光二抗、温育、冲洗、封片、荧光显微镜（激发光:488nm）下观看（详细步骤见第一章材料及方法）。 1.3 收集临床资料 收集患者肾活检时年龄、性别、实验室检查（包括血肌酐、血清白蛋白、24小时尿蛋白定量）。根据患者肾脏组织光镜及电镜病理结果，对41例IMN进行病理分期（Ⅰ-Ⅴ期）。 2.血清中IgA/C3比值在IgA肾病诊断预测中的价值及其与IgA肾病临床及病理联系 2.1 研究对象 收集南方医科大学第三附属医院2009年12月至2015年2月肾活检诊断为 IgA肾病患者66例，其他肾小球疾病患者111例（其中特发性膜性肾病40例，微小病变性肾病33例，非lgA沉积的系膜增生27例和局灶节段性肾小球硬化症11例）和健康对照者40例。并且排除下列:(1)肿瘤、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、过敏性紫癜等继发性IgA肾病;(2)光镜下肾小球数目较少（小于8个肾小球）;(3)肾活检时eGFR＜10 ml/min/1.73 m2。IgA肾病诊断根据免疫荧光结果，在肾小球系膜区以IgA和补体C3沉积为主，伴或者不伴IgG和IgM沉积。本研究所纳入病例均未长期使用免疫抑制剂或（和）糖皮质激素治疗。健康对照组参与者尿常规检查均未见尿蛋白，均无高血压、糖尿病、慢性肾炎等病史。 2.2 临床指标 我们收集患者肾活检时年龄、性别、收缩压、舒张压、血尿酸、血肌酐、血红蛋白(Hb)、血清白蛋白(Alb)、血尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、24小时尿蛋白定量。eGFR使用MDRD公式计算，eGFR=[175×(Scr)-1.234×(Age)-0.179×(iffemale，0.79)]。血清IgA、补体C3使用CRM470调整后的标准化免疫比浊法检测。 2.3 病理分级 所有肾活检穿刺标本均行光镜、免疫荧光和电镜检查。对IgA肾病进行病理分级（包括Lee氏及牛津分级）。肾活检病理的诊断及分级经两位病理医生独立诊断，有争议的诊断经所有作者参与病理讨论后决定。 结果： 1.成人特发性膜性肾病患者肾组织PLA2R1抗原及血清抗PLA2R1抗体的检测 1.1 根据病理类型比较患者的一般资料 IMN组、继发性膜性肾病组及其他肾炎组患者在年龄、性别、24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、血肌酐间差异有统计学意义(P＜0.05)。表明病理类型不同对肾脏的损伤程度有影响，并且肾脏病不同病理类型的发病年龄及性别也不一致。 1.2 IMN肾组织PLA2R1抗原阳性与患者阴性一般资料对比 IMN患者PLA2R1抗原阳性者与患者PLA2R1抗原阴性者在年龄、性别、血清白蛋白、血肌酐及24小时尿蛋白定量之间差异无统计学意义(P＞0.05)。 1.3 IMN及继发性膜性肾病肾组织PLA2R1抗原的阳性率 在41例特发性膜性肾病中，35例患者肾组织发现PLA2R1抗原的沉积;PLA2R1沿肾小球毛细血管袢呈细颗粒状沉积。其中6例特发性膜性肾病患者肾组织中并未发现PLA2R1抗原的沉积。 在继发性膜性肾病（Ⅴ型狼疮肾炎及乙型肝炎病毒相关性膜性肾病）和其他肾炎对照组患者肾组织中均未发现PLA2R1抗原的沉积。 1.4 IMN患者肾组织PLA2R1抗原与血清抗PLA2R1抗体阳性率比较 在41例IMN患者血清中，30例抗PLA2R1抗体阳性（阳性率为73.17％）。肾组织及血清均发现PLA2R1者27例，有8例肾组织PLA2R1抗原阳性但血清抗PLA2R1抗体阴性，3例肾组织PLA2R1抗原阴性血清抗PLA2R1抗体阳性，3例两者均阴性。两种检测方法之间差异无统计学意义(P=0.276)。 结论： 1.在成人IMN患者肾组织中PLA2R1抗原阳性率为85.37％，血清抗PLA2R1抗体阳性率73.17％。肾组织PLA2R1抗原与血清抗PLA2R1抗体阳性率差异无统计学意义。并且肾组织PLA2R1抗原阳性与抗原阴性患者在临床表现上无统计学差异。 2.IgA肾病患者血清IgA/C3比值较其他肾小球疾病组和健康对照组明显升高。血清IgA/C3比值在预测IgA肾病中，其ROC曲线下面积为0.776(高于血清IgA)。IgA/C3比值升高与IgA肾病病理损伤程度无明显相关性。在未开展肾活检的医院及不接受肾活检检查的患者，血清IgA/C3比值在IgA肾病诊断中可起一定辅助作用。
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