摘要
骨的损伤和缺损是一个十分严重的健康问题，已经导致了全球每年成千上万的手术量，特别是复杂因素所致的损伤和畸形、骨质疏松和肿瘤所致的病理性骨折。自体骨、同种异体骨和各种各样的人工材料例如:高分子、无机非金属材料、金属材料和它们的混合物，已经在骨修复或者替代中得到运用。然而，没有一种材料可以即经济又有效的满足患者的治疗需要。 明胶甲基丙烯酰胺(Gelatin Methacrylamide，GelMA)是一种可以很好地模拟天然细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)物理化学性质的理想替代材料。甲基丙烯酸盐基团接枝到明胶侧链的氨基上，然后通过化学交联获得GelMA。化学交联后的GelMA可以在正常体温(37℃)条件下维持稳定，能够增强细胞活力和限制细胞的伸展等，目前已经在软骨修复、功能血管网的生成等方面对它进行了研究。然而，到目前为止没有任何研究团队和组织将其运用至骨再生研究中。可能是其光滑的孔壁与天然骨形貌不符等因素限制了GelMA在骨再生中的运用。 本研究的目的在于合成一种仿生GelMA(Biomimetic GelMA，Bio-GelMA)支架，并且此支架材料能够促进ADSCs的增殖和分化，最终实现骨缺损修复替代的功能。简言之，本研究主要由三个阶段组成。首先，通过热致相分离技术（Thermally Induced Phase Separation TIPS），制造出粗糙表面和多孔侧壁形貌的Bio-GelMA;其次，将ADSCs种植于仿生GelMA支架上诱导成骨分化，研究体外成骨效果;最后，运用裸鼠皮下种植和大鼠颅骨缺损动物模型研究其体内成骨效果。我们的研究内容主要包括如下三个章节 第一章 仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架的合成及表征 目的： 通过热致相分离技术(TIPS)，制造出粗糙表面和多孔侧壁形貌的Bio-GelMA。 方法： GelMA的合成方法:将10％(w/v)明胶溶于50℃双蒸水中，搅拌直至完全溶解。将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液体系内，让其在50℃反应条件下反应3小时。随后，在混合物透析袋内透析并用中性滤纸过滤。最后，过滤后的GelMA溶液放入-80℃冷冻，冷冻干燥，并存储于室温下待用。通过1H NMR评价接枝反应。 结果： 明胶甲基丙烯酰胺的核磁共振波谱显示在5.3ppm和5.6ppm处有波峰，即丙烯酰胺双键波峰所在位置，丙烯酰胺基团取代率为53％。 支架材料的SEM观察结果:Bio-GelMA支架具有低密度、高孔隙率和空隙互相连通的特点。通过Image J软件计算Bio-GelMA的孔隙率为85％。Bio-GelMA支架的孔径大约100～500nm。更重要的是，与传统GelMA支架光滑的侧壁相比，Bio-GelMA支架材料的侧壁含有很多孔隙，互相交通的孔隙及粗糙的侧壁。而且，与传统GelMA支架相比较Bio-GelMA支架材料少了一层薄薄的表皮（上下底面）， 结论： 我们利用热致相分离技术(TIPS)合成了物理结构和化学组成类似于天然骨ECM的支架。 第二章 仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架复合ADSCs的体外成骨研究 目的： 研究仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架与ADSCs共培养并诱导成骨分化的情况。观察ADSCs种植于材料后的不同时间点生物相容性、碱性磷酸酶活性、钙盐沉积量、基因表达水平的变化趋势等评价指标。 方法： ADSCs细胞种植于材料，成骨诱导第7，14，21天后评价其活力。激发/发射滤片设定为488/530nm观察活细胞（绿色），设定为530/580nm观察死细胞（红色）。每个时间点选取6个样本，使用Image J软件计算活细胞和死细胞的数量。 把ADSCs分为两组，分别种植于材料或种植于培养皿中，并加入成骨诱导培养基培养。第7，14和21天后，首先用PBS洗涤各组样品三次;随后，将种植于60mm细胞培养皿中的ADSCs于冰上加入Lysis Buffer裂解，而种植于材料上的ADSCs直接加入Lysis Buffer后用匀浆器研磨。按照说明书步骤（碱性磷酸酶检测试剂盒）使用酶标仪，在405nm处测试吸光度。 茜素红染色(ARS)能够定性定量评价分析成骨细胞的钙盐沉积。ADSCs种植于材料或者种植于培养皿中并用成骨诱导培养基培养。第7，14和21天后，样品首先依次用PBS洗涤三次，4％多聚甲醛固定1小时;然后D-PBS洗涤2次，室温下0.1％ ARS染色15分钟;随后，用D-PBS洗去ARS，在倒置显微镜下观察照片。为了定量分析钙盐沉积，样品再次加入100mM氯化十六烷基吡啶反应30分钟。收集染色液，使用酶标仪在562nm测吸光度。 我们通过RT-PCR来评价重要的骨相关的基因表达水平:使用RNA提取试剂盒分离和纯化总RNA。使用第一链cDNA合成试剂盒，加入逆转录酶使1mgRNA合成第一链cDNA。样品一式三份，使用ABI StepOne Plus系统进行RT-PCR。 结果： 我们观察到材料内有许多ADSCs，且ADSCs在材料表面长势良好。随着时间的推移，ADSCs与支架材料联系越来越紧密，并且，ADSCs牢牢地附着在材料的孔洞骨架上，并可以沿着材料的侧壁走形成列生长。 第14和21天的ALP活性定量分析结果提示材料上种植的细胞的ALP活性明显比对照组的高，而第7天结果无统计学差异。此外，21天较14天的ALP量增加了近一倍。而且随着时间的推移，材料上种植的ADSCs的ALP活性逐渐增加，但对照组则降低。 随着时间的推移，材料上种植的ADSCs组较无材料种植ADSCs组（对照组）钙盐沉积量明显增加且随着时间的推移钙盐沿着支架侧壁沉积。更重要的是，钙盐沉积的定量分析也验证了这一结果。 第7天，材料种植ADSCs组的ALP，BSP， OCN，ColⅠ和OPN基因表达较对照组减低，而OSX和RUX2表达量则增加。而且，第14天和21天的ALP, OSX，OCN和RUX2基因表达结果无统计学差异。第21天的BSP基因表达则下调，而14天的结果则上调。第14天的ColⅠ和OPN的基因表达也下调，而21天的结果则上调。 结论： 在体外条件下，仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架材料能够促进大鼠ADSCs细胞的粘附、伸展、增殖和成骨分化。 第三章 仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架复合ADSCs的体内成骨研究 目的： 研究仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架复合ADSCs种植于动物体内的成骨表现。观察ADSCs种植于材料后植入裸鼠皮下异位成骨效果及大鼠颅骨缺损部位修复效果。 方法： 每只裸鼠制造2个皮下口袋，分别种植两种材料:一侧为未种植细胞的水凝胶（对照组），另一侧为种植细胞的水凝胶（实验组），两种材料在种植前均先在成骨诱导培养基孵育21天，种植材料4周后，处死裸鼠取出植入物。将植入物固定、脱钙5天，梯度脱水，石蜡包埋，切片并H&E染色。将其它的植入物冰冻切片，然后进行H&E染色及免疫荧光检测，目的基因包括:RUX2，collagen1，osteocalcin和osteopontin。 随机选取成年雄性SD大鼠(n=7，200-300g)用乙醚及10％水合氯醛(3.3ml/kg)麻醉，剪去手术区域毛发并用碘伏消毒。切开头皮并剥离覆盖颅骨表面的骨膜暴露颅骨。使用环钻小心地在颅骨两侧进行钻孔（注意保护硬脑膜，以免误伤），制作大小为直径5mm的圆形颅骨缺损。备好两组材料:一组为未种植细胞的水凝胶（对照组），另一组为种植细胞的水凝胶（实验组），两种材料在种植前均先在成骨诱导培养基孵育21天。将两种材料分别植入同一大鼠左右两个颅骨缺损部位。最后缝合皮肤。 植入植入物12周后，处死大鼠。切取颅盖骨并修整，使用Micro-CT评价样品，扫描层薄24μm。使用mimics软件三维重建图像，并研究来自于每组7个样品的重建图像。 样品Micro-CT扫描后，使用Perenyi's溶液脱钙7天，梯度脱水，石蜡包埋，切片，H&E染色及Masson染色，显微镜观察拍照。 结果： 植入物植入4周后的H&E染色结果显示:种植ADSCs材料组（实验组）的支架上可以看到一些成骨细胞集团，分散在大量纤维结缔组织中间。值得注意的是在支架上可以观察到成骨细胞甚至破骨细胞。相反的，未种植ADSCs的材料组（对照组）的纤维结缔组织包裹了材料，但是数量明显较少且未见类骨细胞出现。免疫荧光染色示:与对照组相比，实验组的COLⅠ，OCN，OPN和RUX2表达量明显增加。 Micro-CT分析示:通过与空白组骨体积的实验数据相减的方法，获得新生骨的实验数据，实验组较对照组的骨形成有明显增加，H&E染色和Masson's三染色结果也都提示实验组较对照组的骨形成有明显增加。另外，新骨组织在材料周围含有大量的骨细胞。 结论： 在异位成骨实验中，发现持续的大量成骨组织形成及成骨相关蛋白高表达，但是没有发现异位骨的形成。而且，我们不能判定成骨细胞的来源，是ADSCs还是裸鼠自身细胞。尽管如此，我们的研究证实了支架材料能够促进细胞分化。令人高兴的是，在颅骨缺损修复实验中，ADSCs复合材料组（实验组）结果证实了有新骨形成，提示ADSCs复合明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料可能可以作为骨组织工程良好材料。
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