摘要
膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。据统计，初诊时70％-80％膀胱癌为分化良好或中等分化的NMIBC，首次经尿道膀胱肿瘤切除(TURBT)术后，NMIBC第一年复发的几率为15％-61％，五年内复发率为31％-78％。其中约10％的患者最终进展为肌层浸润性膀胱癌或者转移性膀胱癌;尤其是高危非肌层浸润膀胱癌，行经尿道膀胱肿瘤切除术后5年进展的几率达45％。侵袭和转移是膀胱癌患者的首要死因，国内一项研究显示，各期膀胱癌患者5年生存率分别为:Ta-1期膀胱癌91.9％，T2期84.3％、T3期43.9％、T4期10.2％。国外研究报道，对于肿瘤局限膀胱内并且无淋巴结转移的非肌层浸润性膀胱癌5年和10年无复发生存比例分别为:P0期92％和86％，Pis期91％和89％，Pa期79％和74％，P1期83％和78％。对于肌层浸润性膀胱癌，若淋巴结阴性，5年无复发生存率和10年无复发生存率分别为:T2期:89％和87％，T3a期:78％和76％，T3b期:62％和61％，T4期:50％和45％。而淋巴结阳性患者的5年和10年无复发生存率只有35％和34％。由于膀胱癌患者的生物行为存在明显异质性，所以现在治疗指南推荐紧密的随访和有创的治疗，造成患者大量的经济负担。因此，准确判断出哪些肿瘤具有复发和进展的潜能极其临床意义。有一部分学者认为对于反复复发和容易进展的高危非肌层浸润性膀胱癌应该尽早行根治性全膀胱切除以达到最好的肿瘤控制效果[9]。病理的分级、分期等曾是判断肿瘤预后最好的临床指标之一，例如EORCT评分系统，将其作为判断术后NMIBC复发和进展的几率的重要风险因子;但是在指导个体化治疗方面，其精确度欠佳。目前，在寻找预测膀胱癌进展和复发的生物标记物方面做了大量工作，但是仍然没有较为理想的生物标记物应用临床实践中。 目的： 本项研究拟利用GEO数据库下载的膀胱癌基因表达谱进行深度挖掘，发现NMIBC和MIBC的差异表达基因，并且通过大样本回顾性分析进行验证，探讨影响NMIBC术后复发进展的关键调节基因。在初步研究中我们发现CDH11是促进NMIBC进展的关键因子之一，并初步探讨其在膀胱癌的生物学功能，在临床样本中验证生物学信息的准确性，并阐明其临床意义。对深入研究NMIBC进展的分子机制、指导NMIBC的精准治疗和改善NMIBC的预后具有重要的理论和临床意义。 方法： 1.研究对象 1.1 膀胱癌组织标本 所有标本收集于2007年1月-2014年5月，来自南方医科大学第三附属医院和中山大学附属肿瘤医院泌尿外科。标本分为三组:1.用于实时荧光定量PCR实验的59例冰冻膀胱癌组织和21例癌旁正常膀胱组织;2.用于Western Blot实验的10例冰冻膀胱癌组织和4例癌旁组织。3.用于免疫组化实验的209例石蜡膀胱癌组织以及12例癌旁组织。所有样本经南方医科大学第三附属医院及中山大学附属肿瘤医院的病理科专家明确病理诊断。 1.2 膀胱癌基因表达谱数据 从美国生物技术信息GEO数据库()下载4套基因表达谱，登录号分别为GSE3167 GSE37317，GSE31684和GSE5287，筛选后将132例肌层浸润性膀胱癌和56例非肌层浸润性膀胱癌组织的基因芯片数据纳入实验分析。 2.研究方法 2.1 基因芯片数据分析 使用R语言软件，采用RMA方法和用Entrez基因为中心的CDF文件[14]代替原始的Affymetrix的CDF文件重新归纳基因表达谱数据，以过滤GeneChips上的非特异探针，并且将代表同一Entrez基因的不同探针合并在一个探针集中。采用SAM方法[15]分析MIBC和NMIBC组织之间的差异表达基因，筛选差异表达基因的标准:△=2.25，FDR=0.001。随后采取GenCLiP软件(网站:)对差异表达基因进行后续的Pathway和GO功能注释。 2.2 实时荧光定量PCR分析 采用实时荧光定量PCR方法检测59例膀胱癌组织以及21例癌旁组织中CDH11 mRNA的表达量。TBP作为内参基因，采用2-△△Ct相对定量法来分析和反映样本间CDH11基因的表达差异。 2.3 Western Blot分析 随机挑选5例NMIBC、5例MIBC膀胱癌标本和4例癌旁标本，提取总蛋白进行Western Blot实验，用GAPDH作为内参，进行半定量分析。 2.4 免疫组化分析 收集了209例膀胱癌石蜡组织(包括22例MIBC和187例NMIBC)以及12例正常膀胱组织。使用SP法免疫组化实验检测CDH11蛋白在膀胱癌组织和正常膀胱组织中的表达情况。免疫组化实验评分判断标准:每张玻片在高倍镜下观察5个视野。染色强度得分为:无（0分）、轻度（1分）、中度（2分）和重度（3分）;阳性表达细胞占总肿瘤细胞的比例得分为:无（0分）、≤25％（1分）、≤50％（2分）、≤75％（3分）和＞75％（4分）。总得分=染色强度得分+阳性表达细胞占总肿瘤细胞的比例得分，总分范围0-7分。阳性定义:只要有细胞膜阳性着色（总得分≥1）;阴性定义:细胞膜完全没有阳性着色（总得分=0）。 2.5 Transwell和Boyden实验 使用Transwell和Boyden实验检测CDH11对膀胱癌细胞株T24、BIU87、EJ和5637迁移侵袭能力的影响。 2.6 统计分析 采用SPSS20.0统计软件分析实验数据。除特别说明外，采用t检验统计分析两组间数据;使用卡方检验分析CDH11与临床指标的关系，使用Kaplan-Meier andlog-rank tests方法进行生存分析以及单因数分析，多因素分析使用COX风险模型。P＜0.05有统计学意义。 结果： 1.生物信息学分析结果提示:CDH11等基因介导的EMT现象与NMIBC术后进展密切相关 基因表达谱分析结果显示:414个基因存在差异表达，其中在肌层浸润性膀胱癌中表达上调的基因有185个，表达下调的基因有229个。使用genclip软件对差异表达基因进行基因功能注解，GO分析发现这些差异表达基因与细胞粘附、细胞运动、细胞增殖、细胞凋亡等有关，pathway分析发现差异表达基因主要与整合素信号通路、TGF-β信号通路和细胞外基质等信号通路相关。此外，在414个差异表达基因中有164个基因与EMT相关;其中CDH11基因表达水平差异表达较大，达2.89倍，P＜0.0001。 2.CDH11 mRNA及蛋白在膀胱癌组织中表达上调 实时荧光定量PCR和Western Blot实验分别检测CDH11 mRNA和蛋白在膀胱癌组织中的表达水平。发现相对膀胱正常组织，膀胱癌中CDH11的mRNA和蛋白表达水平均升高，而且MIBC组织中CDH11的表达量高于NMIBC，差异具有统计学意义。免疫组化实验结果显示:正常膀胱上皮组织不表达CDH11，CDH11表达于肿瘤细胞的细胞膜。NMIBC中CDH11表达阳性率为30.5％(57/187)，而MIBC中CDH11表达阳性率为54.5％(12/22)，差异表达具有统计学意义。 3.CDH11促进膀胱癌细胞迁移和侵袭。 实时荧光定量PCR和Western Blot分析发现T24和BIU87细胞株中CDH11mRNA和蛋白表达水平相对较高，而5637和EJ细胞株中表达相对较低;Transwell和Boyden实验发现CDH11促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。 4.CDH11在膀胱癌中的临床意义 临床病理资料分析发现CDH11阳性表达与膀胱癌的肿瘤分级、分期、复发、进展等临床指标呈正性相关;阳性表达CDH11的患者更容易复发和进展。单因素分析和多因素分析发现CDH11阳性表达是影响NMIBC患者的无复发和无进展生存时间的独立危险因素。 结论: 1.通过基因芯片以及生物信息学技术筛选出与膀胱癌进展相关的大量差异表达基因，分析发现这些基因主要涉及整合素信号通路、TGF-β信号通路和细胞外基质等信号通路;且与细胞粘附、细胞运动、细胞增殖、细胞凋亡等有关;而且这些差异表达基因主要与EMT现象相关。 2.CDH11 mRNA和蛋白在膀胱癌组织中表达上调，而且肌层浸润性膀胱癌中的表达水平高于非肌层浸润性膀胱癌。 3.CDH11在T24和BIU87细胞株中相对高表达，在EJ和5637细胞株中相对低表达，具有促进膀胱癌细胞迁移和侵袭的能力。 4.CDH11与膀胱癌分级、分期、复发、进展等临床指标呈正相关，CDH11阳性表达提示患者预后不良。CDH11也许可以作为预测膀胱癌预后的生物标记物。
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