摘要
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，简称金葡菌，不仅是医院内获得性感染的重要病原菌，而且在社区获得性感染中，金葡菌也是引起皮肤、软组织等感染的主要原因。金葡菌的致病作用多样，可引起多种感染性疾病，从轻度的皮肤、软组织感染到危及生命的败血症、心内膜炎、肺炎等，严重危害人类健康。金葡菌除可以表达多种毒力因子致病外，更为人们所忌惮的是其对抗生素耐药的快速形成能力。近年来，随着抗生素的广泛应用，特别是广谱抗生素的使用，金葡菌的耐药形势日益严峻，耐3种以上抗生素的多重耐药菌检出比例越来越高。 以往的研究大多关注于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus，MRSA)，然而仍然有相当部分的感染是由甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible S.aureus，MSSA)引起，在我国MSSA感染约占金葡菌感染的40％，但是对于MSSA的分子特征还缺乏了解。在分子型别上，与MRSA相比，MSSA表现出更高的遗传多样性。在特定地区，MSSA的流行无明显的优势克隆，常常多种分子型别的菌株并存，我国不同的研究中报道的主要MSSA型别也存在差异。研究发现，MSSA携带的多种毒力因子，如肠毒素、杀白细胞素等的表达水平比MRSA高。此外，MSSA菌获得SCCmec耐药盒后即转化为MRSA，是MRSA的重要来源。一般认为，MSSA对除青霉素外的大多数抗生素敏感，然而近年来的研究发现MSSA的耐药水平逐年升高，多重耐药菌株检出率持续上升。 分析MSSA临床菌株的分子特征和耐药表型对于鉴定菌株间亲缘关系、有效控制MSSA的感染和传播具有重要现实意义。在我国，MSSA感染仍然占金葡菌感染的40％左右，然而，现有的研究报道常与对MRSA的分析同时进行，以MRSA为主，尚未见专门针对MSSA的研究报道，对MSSA的分子特征所知有限。本研究对2012年6月至2013年12月期间收集于重庆和乌鲁木齐两座城市的115株MSSA临床菌株进行了研究，综合运用多种分子分型方法，分析菌株的分子特征，在此基础上对菌株的抗生素耐药谱进行检测，探讨菌株分子特征与耐药表型之间的关系。所得结果不仅可以在一定程度上揭示我国MSSA的流行现状，探讨其分子特征与耐药表型的关系，也可以丰富我国金葡菌的分子流行病学资料，为进一步研究金葡菌耐药机制，指导临床抗生素合理应用，防控金葡菌感染提供重要实验依据。 主要研究内容和研究结果如下: 1.MSSA的分子分型研究 (1)葡萄球菌A蛋白基因多态性分析(spa分型):用PCR方法扩增spa基因的X区，测序后获得连续的24bp重复序列，从数据库()中得到每个24bp重复序列相对应的编号，再根据编号和排列顺序确定菌株的spa型别。结果115株MSSA菌株共获得45个spa型别，主要型别有t11413(8.7％，10株)、t571(6.1％，7株)和t7164(6.1％，7/115)，这三种型别占所有菌株的20.9％，另有11株可能为新的spa型别。 (2)多位点序列分析(MLST分型):根据金葡菌7个管家基因(arc，aroE，glpF, gmk,pta，tpi，yqiL)的多态性确定其型别。首先分别PCR扩增每株菌的7个管家基因，测序后提交数据库()获得每个管家基因的序号，然后按顺序依次排列，获得其ST型别，与已知的金葡菌流行株进行比较。115株MSSA菌可分为26个ST型，其中主要型别有ST121(11.3％，13株)、ST15(11.3％，13株)、ST7(10.4％，12株)、ST22(10.4％，12株)、ST398(7.0％，8株)、ST188(6.1％％，7株)以及ST88(5.2％，6株)，占所有MSSA菌株的61.7％。 (3)金葡菌附属基因调节子（agr）分型:金葡菌agr位点的可变区包含编码AgrD的基因序列、编码AgrB的C末端2/3的序列和编码AgrC的N末端的部分序列。不同金葡菌菌株的agr位点可变区呈现出多态性，利用这一点可将金葡菌分为4种不同的agr型别。115株MSSA菌株共检出agrⅠ型71株(61.7％)、agrⅡ型17株(14.8％)、agrⅢ型13株(11.3％)、agrⅣ型14株(12.2％)。 (4)脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型:先将金葡菌包埋于琼脂中，然后用适当的内切酶在原位对细菌的整个染色体进行酶切，电泳时通过不断交替变换电场方向和脉冲时间，使酶切片段在电泳系统中得到较好的分离，最后电泳结果进行聚类分析。结果107株MSSA分离株可分为10个聚类组，依次命名为A-J，其中A型(26.2％，28/107)、B型(26.2％，28/107)和F型(23.4％，25/107)为优势型别，占所有MSSA菌株的75.8％(81/107)。8株ST398型菌株无法分型。 (5)杀白细胞毒素毒力基因(pvl)检测:115株MSSA中有33株显示pvl基因阳性，阳性率为28.7％。 2.MSSA的耐药性分析 检测了115株MSSA对13种临床常用抗生素的耐药情况，结果所有菌株对苯唑西林，利奈唑胺，万古霉素，替考拉宁都敏感;仅有1株对利福平中介耐药;对复方新诺明(28.7％，33/115)、四环素(18.3％，21/115)、庆大霉素(7.8％，9/115)、环丙沙星(5.2％，6/115)、左氧氟沙星(2.6％，3/115)呈不同程度的低水平耐药;而对青霉素(83.4％，96/115)、红霉素(60.0％，69/115)和克林霉素(51.3％，59/115)呈高水平耐药。通常将对3类以上（含3类）抗生素耐药的细菌定义为多重耐药菌(multidrug-resistant，MDR)。我们的检测表明47.8％(55/115)的MSSA菌株为MDR菌株，其中大多数(89.1％，49/55)至少对青霉素、红霉素和克林霉素3种抗生素耐药。用PCR方法检测所有MSSA菌株这3种抗生素耐药基因的携带情况，结果青霉素耐药基因blaZ的携带率为91.3％(105/115)，红霉素、克林霉素耐药基因ermA、ermC携带率分别为30.4％(35/115)、92.2％(106/115)。 结合MSSA菌株的分子特征来看，4株ST943型菌都为MDR菌株;13株ST121型菌中有9株为MDR菌株(69.2％)，而且大多数(88.9％，8/9)有共同的耐药谱(PEN-ERY-CLI);3株ST398型MDR菌株都对至少4类抗生素耐药。此外，大多数(76.0％，19/25)PFGE F型菌株属于多重耐药菌，其中包含一株(ST45-t1081)对7种抗生素耐药。 综上所述，本研究通过分子分型分析揭示了我国重庆及乌鲁木齐地区MSSA的主要种群结构，通过耐药性分析发现了较高的MDR检出率。所分析的MSSA临床菌株具有高度的遗传多样性，优势流行克隆不明显，除国内经常存在的t571外，t11413和t7164也占据一定地位。具有高毒力、高耐药性的ST121克隆在我国以往的报道中少见，在本研究中具有一定优势，值得高度关注。上述结果为了解MSSA的流行病学特征提供了重要实验依据，尽管MRSA仍然是金葡菌感染的主要问题，但是MSSA因为其较强的毒力和日益增长的耐药性也应引起足够的重视。
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