摘要
目的: 阿尔茨海默病是老年人最为常见的神经退行性疾病，以进行性认知功能减退为主要临床特征。目前尚无有效手段或药物来延缓或逆转阿尔茨海默病的疾病进程，成为困扰医学科研的世界性难题。β淀粉样蛋白(Amyloid-beta，Aβ)作为阿尔茨海默病的核心致病物质，在疾病的发生发展过程中起到了重要作用。有鉴于此，Aβ也成为首要治疗靶点。然而，Aβ的产生和代谢调节机制尚不完全清楚。同时，神经营养因子及其相关受体失调在散发性阿尔茨海默病的病理发生过程中具有重要的调控作用，研究表明，阿尔茨海默病患者存在神经营养因子和Trk受体下调现象，而与之相反的是，Aβ，神经营养因子前体蛋白和相关受体如proNGF、p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)和sortilin等神经退行性信号表达上调。p75NTR通过激活不同的共受体，介导发育过程中神经元存活或神经元凋亡两个完全相反的作用。p75NTR在生理条件下，能够被α-肿瘤坏死因子α转换酶（tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme，TACE）水解释放其胞外段(p75 neurotrophin receptor ectodomain，p75ECD)，C端随后被γ分泌酶进一步剪切生成胞内段(intracellular domain，ICD)。以往研究表明，p75NTR在阿尔茨海默病病理机制中有两方面的作用，一方面，p75NTR能够与Aβ相结合，介导神经元凋亡，同时可正反馈的促进Aβ过度产生、聚集;另一方面，p75ECD是一个生理性的神经保护因子，我们过去的研究证实，通过脑内基因转染人p75ECD以提高脑内p75ECD水平，可以减少Aβ产生，拮抗其神经毒性作用，抑制Aβ脑内沉积，表明p75ECD具有AD防治潜力。 对于Aβ的清除，过去的研究主要聚焦在使药物进入脑内而发挥作用。然而，在抗Aβ免疫治疗中，抗体进入脑内可诱发一系列副作用，包括自身免疫性脑炎、血管源性脑水肿、扬灰效应等。我们近期研究发现，脑组织中约40％的Aβ能够从脑内流入外周循环，而后被外周器官清除。Aβ外周清除是保持脑组织Aβ维持动态平衡的有效机制。从外周途径来清除脑内Aβ是一条更为安全和简便的潜在途径。因此，我们探讨通过外周肌肉转染表达p75ECD，来清除脑内Aβ的作用和相关机制，并初步观察评价其安全性。 方法: 我们首先通过硫磺素T实验与透射电镜实验在体外水平探讨p75ECD对Aβ纤维的抑制聚集能力和促进已经聚集的Aβ纤维解聚能力;然后，我们通过肌肉注射AAV病毒载体转染表达p75ECD基因，将APP/PS1转基因小鼠(AD小鼠)分为p75ECD转染表达组、转染对照组和AD空白对照组和野生型小鼠对照组，于AD小鼠3月龄时肌肉注射AAV病毒，转染对照组注射AAV-GFP(绿色荧光蛋白)，所有试验组小鼠于12月龄时通过Morris水迷宫、Y迷宫和旷场实验检测学习记忆能力情况，通过刚果红染色、6E10免疫组织化学染色和ELISA、免疫印迹等方法进行定量分析不同组间AD相关病理变化情况、beta-淀粉样蛋白的变化情况等，观察p75ECD对AD小鼠的预防作用，并进一步在整体水平和离体细胞培养水平（SH-SY5Y细胞系和皮质神经元原代培养）探讨相关机制，最后观察实验过程中小鼠的行为、饮食等日常活动，通过HE染色和ELISA等方法检测分析比较小鼠病理变化、体重、代谢和自身免疫水平变化情况，以初步评价外周转染表达p75ECD的安全性。 连续性变量以MEAN±S.E.M.表示，重复测量数据（如水迷宫逃逸潜伏时间和游泳距离）分析采用Two-Way ANOVA分析;其余多组间比较采用One-Way ANOVA分析。非正态分布数据采用非参检验。当P＜0.05，我们认为差异具有统计学意义。 结果: 1.p75ECD能够抑制Aβ聚集、促进Aβ纤维解聚。 体外实验中，我们通过硫磺素T实验与透射电镜实验观察p75ECD与Aβ相互作用情况。实验结果显示，p75ECD处理后，Aβ聚合物聚集的纤维稀疏、散乱，而已经形成的Aβ聚合纤维中加入p75ECD处理一段时间后，发现原本排列较致密的纤维发生崩解、形态结构松散，数量减少。而等剂量的HuIgG-Fc、FGFR4-Fc却不影响Aβ的聚集和解聚。因此，研究表明p75ECD对Aβ具有抑聚、解聚能力。 2.外周肌肉转染p75ECD基因，主要在外周肌肉组织表达、分布。 研究中我们通过基因工程方法将p75ECD-Fc基因整合到腺相关病毒-8(AAV-8)，构建了AAV-p75ECD-Fc质粒，并将该质粒注射到3月龄AD小鼠小鼠左后肢股内侧肌，以达到转染目的。我们在注射后不同时间点检测p75ECD-Fc表达水平，免疫组化结果显示p75ECD-Fc基因在AD小鼠的左后肢肌肉中稳定持续表达，ELISA检测发现p75ECD在血浆中较对照组显著升高。上述实验表明，外周转染p75ECD-Fc基因后，肌肉是其主要表达部位，表达的p75ECD-Fc蛋白主要分布在外周，未进入脑内。 3.外周肌肉转染p75ECD基因改善APP/PS1小鼠认知功能 我们通过Morris水迷宫、Y迷宫和旷场实验等行为学实验检测发现，与GFP对照组相比较，p75ECD-Fc组AD小鼠表现更佳，具体体现在Morrs水迷宫中逃逸潜伏期和平台逃逸距离显著降低，Y迷宫实验中自发交替反应次数和新臂进入次数明显增加，旷场实验中小鼠移动距离更长。行为学实验表明外周转染p75ECD能够显著改善AD小鼠的空间学习记忆能力，工作记忆能力和自主探索能力，小鼠认知功能损害得到了修复。 4.外周肌肉转染p75ECD基因降低APP/PS1小鼠Aβ水平 刚果红和免疫组织化学染色发现p75ECD组小鼠皮层和海马内的Aβ斑块明显减少，ELISA分析发现可溶性Aβ、疏松Aβ纤维斑块、致密Aβ斑块和血浆中Aβ变化与免疫组化结果保持一致。BACE1是Aβ代谢过程中的限速酶，可以和γ-分泌酶一起将APP剪切生成Aβ。实验中发现p75ECD能够抑制BACE1表达及其活性，减少APP的Aβ代谢途径。Western-blot检测发现Aβ的主要降解酶(NEP，IDE)和主要跨血脑屏障转运蛋白(LRP、RAGE)均未见明显改变。原代神经元培养实验中，Aβ42能够显著促进BACE1和sAPP表达，两者之间存在着剂量依赖关系。如果加入重组的p75ECD-Fc或敲除p75NTR基因，这种效应便会不复存在。以上实验结果表明，p75NTR参与了APP的Aβ代谢途径，是Aβ上调BACE1表达调控中的关键受体，在Aβ-BACE1恶性循环中发挥了重要作用，促进了AD的发生发展，而p75ECD能够阻断Aβ-BACE1恶性循环。 5.外周肌肉转染p75ECD基因减轻APP/PS1小鼠Tau磷酸化水平 免疫组化图片和分析结果显示，p75ECD组AD小鼠海马Tau-phospho-Ser396阳性神经元面积比对照组显著降低，这与WB分析其他Tau磷酸化位点(serine396，262，199，threonine231)得到的结果相一致。通过SH-SY5Y细胞实验，我们发现Aβ能够上调GSK3β活性而加剧Tau过度磷酸化，重组的p75ECD可以竞争性与Aβ结合而抑制Tau磷酸化反应。 6.外周肌肉转染p75ECD基因抑制APP/PS1小鼠炎症反应 GFAP和CD45免疫组化染色结果显示，p75ECD组AD小鼠大脑皮层和海马中活化的星形胶质细胞和小胶质细胞阳性面积明显少于对照组。p75ECD组脑组织TBS提取物和血浆中的炎症因子（IL-1β，IL-6，IFN-γ和TNF-α）水平均呈下降趋势，说明p75ECD可以抑制AD小鼠的神经胶质细胞活化，减轻炎症反应。 7.外周肌肉转染p75ECD基因预防AD途径安全 整个动物实验过程中，所有动物健康状况良好，未出现死亡或明显行为异常。我们在本研究中专门评价了外周转染p75ECD后小鼠脑和外周器官可能存在的副作用，HE染色未发现大脑皮层、海马，肝、肺、肾、脾、肌肉和小肠等主要器官存在异常病理变化。动物饮食、体重和代谢酶(AST，ALT)也未见明显差异。另外，为了评估p75ECD受否会导致自身免疫反应，我们通过ELISA检测了p75ECD组、GFP对照组和野生型小鼠血浆中p75ECD自身抗体(p75ECD-Ab)水平，结果发现三组之间无显著差异，且p75ECD-Ab水平很低。这些资料说明p75ECD在体内长期表达没有对小鼠机体带来明显的副作用，表明AAV外周转染p75ECD防治AD的方法是安全的。 结论: 1.p75ECD能够抑制Aβ聚集、促进Aβ纤维解聚。 2.AD小鼠外周肌肉转染p75ECD基因后能够有效清除脑内Aβ，并减轻AD相关病理损害，改善学习记忆障碍。 3.外周肌肉转染p75ECD基因是一条潜在的安全有效的AD防治途径。
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