摘要
目的： 精神分裂症(Schizophrenia)是一种影响思维、感觉、心境和社会性的复杂而严重的精神疾病，多在青壮年缓慢或亚急性起病，全球发病率接近1％。临床症状上由譬如幻觉、妄想、怪异行为的阳性症状，以及情感低落、快感缺乏、刻板思维、社交退缩等阴性症状构成，并可伴有认知功能损害症状。这些精神症状表现和神经系统功能往往是难以分开的，比如γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)能系统假说就认为，精神分裂症患者存在GABA能低下，精神分裂症恶化可能是GABA递质逐步缺乏的表现，且与精神分裂症阴性症状和认知损害症状相关。 GABA是脊椎动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，由谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）催化谷氨酸脱羧而合成，再经囊泡释放，激活突触后神经元细胞膜上的受体发挥作用，此外释放于细胞间的递质还需要由GABA运载体(GABA Transporter, GAT)及时再摄取，这整个过程称为GABA能的传递。突触后神经元细胞膜上的GABA受体有A、B两型，A型GABA受体属于离子通道型受体，是由a1-α6、β1-β3、γ1-γ3、ρ1-ρ3、π、ε、δ和θ多个亚基组成的五聚体复合物，其中a1、β2、γ2亚基是构成功能性受体的主要组分;介导GABA能快速突触反应。B型GABA受体属于G-蛋白耦合受体，是由GABBR1和GABBR2组成的二聚体复合物;介导GABA能缓慢突触反应。 在此GABA能的传递通路中，我们最关注的是编码GABA(A)受体β2亚基的GABRB2基因，并已经通过病例对照研究、细胞实验，及小鼠实验发现了其DNA多态性、mRNA表达异常、蛋白受体功能受损以及表观修饰异常都可能与精神分裂症有关;该通路中的GAD1，GAD2基因同样有着充足的精神分裂症易感性证据，三者均被收录于SZgene论坛数据库中;而GAT1基因作为编码脑内转运GABA的GAT蛋白最主要的基因，也有部分与精神分裂症相关的报道。 精神分裂症致病是由遗传和环境因素共同起作用，并由表观调控介导的。上述基因中，对GAD1基因的表观调控研究相对较多，有小鼠实验发现表观药物甲硫氨酸(L-Methionine，MET)暴露可诱导产生精神分裂症类似行为，并伴随着RELN和GAD1基因启动子区高甲基化改变，且通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(Valproate acid，VPA)干预，在逆转异常行为的同时降低了RELN的甲基化。而我们对GABRB2基因的前期实验结果也显示，在临床精神分裂症患者中，GABRB2基因内含子8和9上的疾病相关SNP存在基因印迹现象，是精神分裂症患者中出现基因型依赖性RNA表达降低的表观调控机制;此外我们还发现精神分裂症患者GABRB2基因启动子区存在显著的高甲基化现象。 我们希望通过本研究揭示模式生物斑马鱼中gabrb2基因的发育生物学信息，尤其是甲基化调控信息;再利用表观药物MET暴露构建斑马鱼精神分裂症行为学模型，并系统检测gabrb2基因（GABRB2同源基因）和其他联系紧密的GABA能传递通路基因(gad1b，GAD1同源基因;gad2，GAD2同源基因;slc6a1b, GAT1同源基因)的甲基化及表达改变，以期对模型背后机制进行解释，并进一步为精神分裂症发生或发展的监测、治疗药物的开发提供靶点。 方法： 1.实验动物:本课题所用野生型AB系斑马鱼，全部由南方医科大学发育生物学教研室提供;其中，6-18月龄的成鱼用于普通交配产卵;6-11月龄的成鱼用于药物处理及后续试验，并使雌雄比例均衡。 2.实验方法: (1)斑马鱼的饲养:斑马鱼饲养在专门的鱼房中，参照Westerfield的方法进行。重要参数如下:鱼房昼夜光照周期为日∶夜=14∶10，反渗透净水机制备的养鱼系统水，保持pH值7.2-7.6，水温28.5-29.5℃，电导率450-550μs/cm。 (2)斑马鱼发育过程中甲基化图谱的构建:先进行限制性内切酶酶切，再结合荧光偏振的方法(FPDM)检测全基因组甲基化;结合荧光定量PCR的方法检测gabrb2基因启动子区甲基化。 (3)斑马鱼发育过程中gabrb2 mRNA表达图谱的构建:先提取总RNA后逆转录为总cDNA，再应用荧光定量PCR的方法检测。 (4)斑马鱼神经发育过程中gabrb2在脑组织内的定位:先需设计构建gabrb2基因的反义RNA探针，收集斑马鱼几个重要神经发育时间点的胚胎，以及6dpf之前的幼鱼，再使用整体原位杂交技术定位基因表达。 (5)斑马鱼成鱼药物处理:采用浸泡给药，所用表观药物MET参考Vuaden的实验，并增加了一个浓度，最终以低中高三个浓度:1.5mM，3.0 mM，6.0mM，以及不加药物的空白对照，连续处理7天，每天换药。 (6)斑马鱼行为学检测:进行了三种行为学实验，包括检测基本精神状况及自发运动的新鱼缸实验(Novel tank test)，检测社交行为检测的社交趋避实验(Social interaction test)，以及检测认知行为的T迷宫实验(T-maze tank test)。三种实验时间均需控制在当日光照后的4.5-9小时内进行(13:00-18:00)，实验开始前，先将受试鱼转移至行为学检测所用场地，并给予受试鱼30 min时间来适应周围环境。三种实验均采用先录制后分析的方式，前两种通过EthoVision2.1软件进行分析，T迷宫实验则由培训过的研究人员通过盲法人为分析。 (7)斑马鱼MET暴露后全基因组及GABA能传递相关基因的甲基化及mRNA表达分析:方法同发育过程中的相应检测，但基因除了gabrb2再加上gad1b, gad2和 slc6a1b。 3.统计方法:斑马鱼发育过程中全基因组甲基化、gabrb2基因启动子区甲基化和mRNA表达、新鱼缸实验、MET处理后各基因的启动子区甲基化和mRNA表达，依据方差齐性检验选用方差分析(ANOVA)或布朗分析(Brown-Forsytheanalysis)，并相应附以LSD或Dunnett T3的后检验;社交趋避实验、T-迷宫实验采用独立样本的t检验进行分析;甲基化和表达的相关性采用Spearman相关分析;p值小于0.05认为有统计学差异。 结果： 1.斑马鱼全基因组甲基化水平随着发育而持续增加，尤其是8-16hpf的神经系统发育早期，与0-4hpf的神经系统发育准备期相比，甲基化提升最明显，约增加了一倍，之后甲基化水平基本稳定，提升程度有限。 2.斑马鱼gabrb2基因启动子区甲基化水平随着发育而降低，检测的两个CCGG位点得到的结果均是如此，但距离转录起始点(TSS)-1336 bp位置的CCGG变化更明显。而斑马鱼gabrb2基因mRNA表达在发育初始有一短暂下调，随后持续升高，且成鱼比幼鱼要高很多，转折点在16 hpf-24 hpf间，且明显升高出现在2dpf后，即GABA能神经元出现，分泌GABA神经递质后。 3.整体原位杂交结果显示gabrb2从24 hpf开始，随着大脑形态分化，出现特异信号，定位于前脑、中脑、中脑后脑边界，2dpf开始在后脑也出现表达，且3 dpf-6 dpf斑马鱼大脑形态和gabrb2表达定位都非常稳定。 4.行为学实验显示，高剂量MET暴露诱发了斑马鱼社交障碍和学习记忆障碍，这是精神分裂症的核心阴性症状和认知损害症状的表现;并降低了斑马鱼的焦虑水平，但未改变其自发运动模式。 5.MET暴露广泛升高了全基因组和4个目标基因启动子区的甲基化水平，尤其是gabrb2-1336和gad1b-1397 CCGG位点。但即使是高剂量MET暴露，仍然未能引起GABA能传递系统4个目标基因mRNA表达显著下调。 6.相关分析显示，斑马鱼发育过程中gabrb2-1336 CCGG位点甲基化与其mRNA表达整体上呈负相关（尤其是经过表达转折点后），而MET暴露后相关性消失;gad1b-1397 CCGG位点甲基化受MET提升明显，与其表达同样不相关。 结论： 1.发育过程中，斑马鱼gabrb2启动子区（尤其是-1336 CCGG位点）甲基化总体上负向调控mRNA表达，尤其是GABA能神经元出现后。 2.高浓度MET暴露能在野生型AB系斑马鱼中模拟精神分裂症阴性症状和认知损害症状，以此构建精神分裂症模型。 3.gabrb2及gad1b的表观失调（主要表现在gabrb2-1336 CCGG位点和gad1b-1397 CCGG位点的甲基化失调），加上各GABA能传递相关基因启动子区的异常高甲基化，可能共同引起精神分裂症的阴性症状和认知损害症状发生。
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