摘要
本实验通过建立牙周炎复合肥胖小鼠模型，检测各组小鼠模型脾脏巨噬细胞表型极化及相关炎性细胞因子mRNA相对表达水平的差异，及血清TNF-a，IL-1β，IL-10的表达差异，探讨牙周炎复合肥胖状态与脾脏巨噬细胞乃至机体系统性免疫状态的关系。 第一章 食诱导型肥胖伴牙周炎的小鼠模型建立 目的：建立肥胖复合牙周炎小鼠模型，为下一步研究牙周炎复合肥胖对脾巨噬细胞的影响奠定基础。 方法：1.取44只小鼠随机分为高脂饲料组(high fat diet，HF)和低脂饲料组两组(low fat diet, LF)(HF组22只、LF组22只)，以标准60 kcal％高脂饲料和10 kcal％低脂饲料喂养16周，诱导肥胖。 2.诱导时间结束后，将每个饲料组分为真性结扎组（P组）和假性结扎组（C组），P组采用丝线结扎法诱导实验性牙周炎，C组做对照处理。牙周结扎期为十天。得到肥胖复合牙周炎组(HFP)小鼠，对照组(LFC)小鼠，肥胖组(HFC)小鼠，牙周炎组(LFP)小鼠每组各11只。 3.取上颌骨进行HE染色以观察牙周组织病理学改变(n=3)。 结果：采用于高脂饲料喂养法可建立肥胖大鼠模型，建模时间约8周;牙周结扎以涂布牙龈卟啉单孢菌的丝线10天可以建立牙周炎小鼠模型;而于小鼠新生期予以高脂饲养并于牙周结扎以涂布牙龈卟啉单孢菌的丝线10天，可成功建立牙周炎复合肥胖的小鼠模型;本模型的成功建立为研究牙周炎与肥胖对小鼠脾脏巨噬细胞免疫功能的影响奠定模型基础。 第二章 牙周炎复合肥胖小鼠血清炎症因子浓度的检测 目的：研究各组小鼠血清相应炎症因子浓度变化差异，以探讨肥胖及牙周致病菌感染对脾脏及全身系统性免疫功能的影响， 方法：1.DIO16周小鼠44只，随机分为高脂饲料组(HF)和低脂饲料组(LF)饲料诱导16周后，组内随机分为真性结扎组(P)、假性结扎组(C)，进行实验性牙周炎诱导，牙周结扎期10天，得到肥胖复合牙周炎组(HFP)小鼠，对照组(LFC)小鼠，肥胖组(HFC)小鼠，牙周炎组(LFP)小鼠每组各11只 2.蛋白芯片法检测血清炎症因子:各组小鼠眼球取血，高速离心法沉淀分离血清，利用蛋白芯片法检测各组血清促炎型炎症因子TNF-a、IL-1β，抑炎性细胞因子IL-10反应差异(n=4～7)，以观察肥胖状态下，牙周炎对全身免疫功能的影响。 3.应用软件spss20进行统计分析。先对各指标行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用析因设计，分析两种干预主效应及交互作用，计量资料比较采用单因素方差分析，LSD检验比较两组间差异，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：对比各组血清炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-10)的反应差异(n=4～7)，One-way ANOVA分析显示，16周时肥胖小鼠的IL-1β，IL-10，TNF-α浓度相对于对体重组正常显著上调(IL-1β:F=5.475，p＜0.05 IL-10:F=11.557，p＜0.05;TNF-α:F=17.76，p＜0.01)，16周时，在肥胖状态下，牙周炎小鼠的TNF-α，IL-10浓度相对于单纯肥胖小鼠受到显著抑制(TNF-a:F=6.60，p＜0.01;IL-10:F=17.88，p＜0.01); 结论：肥胖状态使小鼠脾IL-1β，IL-10，TNF-α血清浓度水平上升。肥胖状态下牙周致病菌感染使小鼠的TNF-α，IL-10浓度相对于单纯肥胖小鼠受到显著抑制，提示肥胖复合牙周炎状态的小鼠出现了一定程度的免疫耐受。 第三章 牙周炎复合肥胖小鼠脾脏巨噬细胞表型的检测 目的：研究肥胖状态下牙周炎小鼠脾脏巨噬细胞相对数量、表型比例及功能的影响，以探讨肥胖及牙周致病菌感染对全身系统性免疫功能的影响. 方法：1.DIO16周小鼠44只，随机分为高脂饲料组（HF）和低脂饲料组(LF)饲料诱导16周后，组内随机分为真性结扎组(P)、假性结扎组(C)，进行实验性牙周炎诱导，牙周结扎期10天，得到肥胖复合牙周炎组(HFP)小鼠，对照组(LFC)小鼠，肥胖组(HFC)小鼠，牙周炎组(LFP)小鼠每组各11只 2.处死小鼠后，在无菌环境中取出小鼠脾脏并分离脾脏单个核细胞，计数，应用流式细胞术(fluorescence activated cell sorting，FACS)检测单核巨噬细胞及其M1，M2表型的比例。 3.应用软件spss20进行统计分析。先对各指标行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用Two-way-anova析因设计，分析两种干预主效应及交互作用，计量资料比较采用单因素方差分析，LSD检验比较两组间差异，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：M1型:与对照组LFC=[（11.47±6.5）％]及肥胖组HFP=[4.04±1.01)％](p=0.032＜0.05)相比，肥胖复合牙周炎组HFP=[（5.22±2.33）％](p=0.031＜0.05)的M1型巨噬细胞占脾成熟巨噬细胞比例下降。 M2型巨噬细胞:肥胖复合牙周炎组.（HFP=33.38％±11.75％）＞肥胖组（HFC=44.81％±18.12％）＞对照组（LFC=22.01％±16.89％）＞牙周炎组(LFP=23.24％+18.97％).与对照组相比，肥胖组M2巨噬细胞比例明显上升(LFC=22.01％±16.89％ vs HFC=44.81％±18.12％，p＜0.05)。肥胖可使M2型巨噬细胞在脾巨噬细胞中的比例上升。 结论:肥胖状态能通过上调对炎症有抑制作用的M2巨噬细胞表型极化比例，抑制巨噬细胞向促炎的M1型极化。牙周炎在肥胖状态基础上进一步抑制M1巨噬细胞比例。 第四章 肥胖状态下牙周炎对炎症因子mRNA转录水平的影响 目的：研究各组小鼠脾脏巨噬细胞分泌炎症因子功能的差异，观察血清相应炎症因子变化，以探讨肥胖及牙周致病菌感染对脾脏及全身系统性免疫功能的影响. 方法：1.DIO16周小鼠44只，随机分为高脂饲料组(HF)和低脂饲料组(LF)饲料诱导16周后，组内随机分为真性结扎组(P)、假性结扎组(C)，进行实验性牙周炎诱导，牙周结扎期10天，得到肥胖复合牙周炎组(HFP)小鼠，对照组(LFC)小鼠，肥胖组(HFC)小鼠，牙周炎组(LFP)小鼠每组各11只 2.无菌条件下处死小鼠，分离脾脏，液氮冻存后研磨裂解脾脏组织，实时荧光定量PCR法检测各组脾脏中M1型巨噬细胞相关炎型细胞因子TNF-α、IL-1β，M2型巨噬细胞相关细胞因子IL-10 mRNA相对表达水平的差异。 3.实时荧光定量PCR法检测各组脾脏中巨噬细胞相关促炎型细胞因子TNF-α、IL-1β，抑炎性细胞因子IL-10 mRNA相对表达水平的差异。 4.应用软件spss20进行统计分析。先对各指标行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用Two-way-anova析因设计，组间两两比较采用独立样本T检验， 结果：1实时荧光定量PCR法检测脾脏巨噬细胞相关细胞因子mRNA:与对照组相比，肥胖状态下M1型巨噬细胞炎症因子IL-1βmRNA表达水平下降(HFC=0.59±0.23，p＜0.05)的同时IL-10mRNA(4.03±0.29，p＜0.05)表达水平升高。肥胖复合牙周致病菌感染状态下M1型巨噬细胞炎症因子IL-1βmRNA表达水平下降（0.28±0.04，p＜0.05）的同时IL-10mRNA(4.03±0.29，p＜0.05)表达水平升高。与单纯牙周炎组（0.62±0.28，p＜0.05）相比，肥胖复合牙周炎组IL-1βmRNA的表达水平下降(p＜0.05)，IL-10mRNA表达水平升高。 全文结论:通过血清炎症因子水平检测实验，发现肥胖状态使机体炎症因子浓度升高，机体处于低度炎症状态;在肥胖状态下，进一步的牙周感染状态使血清促炎因子浓度下降，下调机体炎症水平，这可能与在肥胖机体已有低度炎症状态下，牙周感染的发生诱发了机体的免疫异常反应有关，即机体对持续10天的牙周致病菌感染产生了免疫耐受反应。 通过流式细胞检测数发现，肥胖状态对小鼠脾巨噬细胞活化有一定抑制作用，且能通过上调对炎症有抑制作用的M2巨噬细胞表型极化比例，抑制促炎的M1型巨噬细胞极化比例。牙周炎在肥胖状态基础上进一步抑制M1巨噬细胞比例。 通过PCR实验发现，肥胖状态下调M1型巨噬细胞炎症因子IL-1β的相对表达水平。上调牙周致病菌感染机体M2型巨噬细胞炎症因子IL-10的相对表达水平。 肥胖状态下小鼠脾巨噬细胞向M2型极化增多，脾脏组织中对炎症有调节抑制作用的细胞因子IL-10 mRNA相对表达水平上升，脾巨噬细胞向M1向极化受到抑制，有促炎作用的细胞因子IL-1βmRNA相对表达水平下降。而牙周炎对肥胖机体的血清促炎因子TNF-α，IL-1β浓度升高有抑制作用，在脾脏组织则表现为进一步抑制脾巨噬细胞向M1型极化，即肥胖机体的慢性低度炎症状态使脾巨噬细胞产生向对炎症有调节作用的M2型极化增多，对炎症有促进作用的M1型极化减少，对机体的炎症水平产生负向调节作用。
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