摘要
目的：c-Maf蛋白在多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)中高表达，是MM的主要致病蛋白之一。泛素-蛋白酶体途径是c-Maf蛋白的主要降解通路，寻找与c-Maf相关的特异性泛素化酶及去泛素化酶并阐明其作用机制对于MM的治疗有着重要意义。目前尚不清楚有哪些酶参与了c-Maf的泛素化过程，因此本实验利用亲和纯化耦联质谱法(Affinity purification coupled with tandem mass spectrometry，AP-MS)筛选并鉴定了c-Maf蛋白的去泛素化酶(Deubiquitinase，DUB)USP5，进一步研究其对c-Maf蛋白泛素化水平和蛋白稳定性的影响，以期为MM的靶向治疗提供一定理论依据。 方法：⑴在HEK293T细胞中转染c-Maf质粒，使c-Maf蛋白过表达，并检测与c-Maf其具有相互作用的蛋白质，与数据库比对分析质谱结果中的泛素化酶及DUBs；⑵质谱分析的结果提示去泛素化酶USP5可能和c-Maf结合，因此共转染c-Maf和USP5质粒，用特异性抗体通过免疫沉淀富集c-Maf蛋白，检测USP5与c-Maf是否具有共结合的相互作用；并检测在泛素过表达的情况下，USP5对c-Maf泛素化水平是否具有抑制作用；⑶在过表达c-Maf及USP5的情况下，Western blot(WB)检测c-Maf蛋白水平的变化，分析USP5对c-Maf蛋白稳定性影响的量效、时效关系；过表达c-Maf及USP5，36 hr后用放线菌酮(Cycloheximide，CHX)处理不同时间，WB检测c-Maf蛋白水平，分析USP5对c-Maf蛋白半衰期的影响；⑷c-Maf属于大Maf家族成员之一，而另外两个大Maf家族成员MafA及MafB也都与MM的发生具有一定的关系，为了分析USP5对c-Maf的蛋白稳定作用是否具有一定的特异性，分别利用WB及CHX研究了USP5对MafA、MafB蛋白水平及半衰期的影响；⑸细胞周期蛋白D2(Cyclin D2，CCND2)是c-Maf的下游靶基因之一，为了研究USP5的去泛素化作用对c-Maf蛋白功能的影响，本实验构建了荧光素酶-CCND2启动子质粒(pGL4-CCND2-Luci)，与USP5、c-Maf质粒共转染48 hr，分析荧光素酶活性的变化，同时WB检测c-Maf的蛋白水平，以分析USP5对c-Maf转录活性的影响；⑹c-Maf蛋白共有14个有可能发生泛素化的赖氨酸残基，为了明确USP5的具体作用位点，本实验构建了12个c-Maf单赖氨酸位点突变体，以及1个33/34位点的双位点突变体，将各突变体分别与USP5质粒共转染，WB检测USP5对各c-Maf突变体蛋白水平的影响，分析USP5使c-Maf发生去泛素化的可能位点；⑺USP5共有5个功能结构域，本研究分别构建了USP5不同结构域的5种截断体，并分别与c-Maf质粒共转染，WB检测不同截断体对c-Maf蛋白水平的影响，分析USP5的哪些结构域可以增强c-Maf蛋白的稳定性；⑻临床上c-Maf主要在MM患者中高表达，并与MM的发生及预后密切相关。我们前期的研究发现大部分MM细胞株都存在c-Maf的高表达情况，USP5作为c-Maf的候选DUB，是否也存在不同种类细胞株的差异性表达情况？本研究分别收集了MM细胞株、白血病细胞株以及其他多种实体瘤细胞株，WB检测USP5在不同肿瘤细胞中的蛋白表达水平。 结果：①在HEK293T细胞株中过表达c-Maf后，AP-MS发现共有104个蛋白质出现了特异性表达，提示这些蛋白可能存在与c-Maf的相互作用关系。经过比对数据库的检索及功能分析，发现去泛素化酶USP5的表达与c-Maf显著相关，可能是c-Maf的特异性DUB；②共转染USP5及c-Maf的情况下，USP5与c-Maf蛋白发生了明确的共沉淀作用，USP5也显著降低了c-Maf蛋白的泛素化水平；③随着USP5质粒转染量的提高以及转染时间的延长，c-Maf蛋白水平逐渐提高，提示USP5对c-Maf的降解具有抑制作用，并使c-Maf蛋白的半衰期延长；④USP5也可使MafB的蛋白水平提高，半衰期延长；但是其对MafA的蛋白水平和半衰期没有明显变化，提示USP5对c-Maf的作用具有一定程度的选择性和特异性；⑤USP5使c-Maf下游靶基因CCND2的荧光素酶活性增强，提示其对c-Maf蛋白的稳定作用使c-Maf的转录活性得到提高；⑥USP5可使c-Maf的K347位点突变体、K308位点突变体的蛋白水平提高，提示USP5使c-Maf发生去泛素化的作用位点可能是K347和/或K308赖氨酸残基；⑦USP5的5种截断体中，UBA1-UBA2结构域使c-Maf的蛋白水平提高；⑧USP5在MM细胞株中的蛋白表达水平比其他细胞系高。 结论：利用AP-MS筛选并发现了与c-Maf相关的去泛素化酶USP5，进一步的分子生物学实验发现USP5与c-Maf存在蛋白间的相互结合，过表达USP5可以降低c-Maf的泛素化水平，使c-Maf的蛋白水平增高、半衰期延长、转录活性提高，提示USP5可能是c-Maf的DUB。进一步的研究发现USP5主要作用于c-Maf的K347和/或K308位点，主要通过其UBA1-UBA2结构域发挥稳定c-Maf的作用。另外，相比于白血病细胞株以及乳腺癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌等实体瘤细胞株，USP5在MM中呈现出高表达，与c-Maf的表达谱类似。
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