摘要
肺癌是全球范围内发病率及死亡率最高的肿瘤之一，严重危害人类健康。目前，外科手术、化疗、放疗仍是肺癌的主要治疗方式。近年，随着多学科综合治疗(multidisciplinary team，MDT)的发展，肺癌的治疗取得了长足的进步。然而，肺癌5年生存率仍徘徊在15%左右。精准医学模式是当今肿瘤治疗的趋势和方向，其关键是利用有效的生物标志物，区分目标人群，从而进行特异性个体化治疗。因此，寻找肺癌新的有效分子标志物以及潜在治疗靶点就显得尤为重要。 随着人类基因组计划的完成，对肺癌在基因水平有了全新的认识。可以认为，在分子基因水平肺鳞癌和肺腺癌是“两种疾病”。现有资料也提示在肺腺癌中可能更易发现生物标志物，并可能从中获益。 沉默信息调节因子1（silent information regulator1,SIRT1)是一种功能类似烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）-依赖型组蛋白去乙酰化酶。SIRT1通过去乙酰化修饰作用，不仅作用于组蛋白，而且可作用于多种参与细胞衰老、凋亡、分化和肿瘤发生的基因及蛋白的表达。 研究表明，SIRT1的表达水平与肿瘤密切相关，可能是肿瘤的潜在治疗靶点。有趣的是，SIRT1在不同类型的肿瘤中表现出截然不同的作用。一方面，SIRT1可能作为一种促癌因子下调p53等抑癌因子。另一方面，SIRT1也可抑制炎症和致癌的转录因子活性，以及通过维持基因稳定性发挥抑癌作用。近年，有少量研究报道探讨SIRT1在肺癌中作用，但结论并不一致。因此，有必要探讨SIRT1对肺腺癌生物学行为的影响及可能的分子机制，为阐明SIRT1在肺腺癌发生发展中的作用提供理论依据和实验基础。 目的： 1.观察SIRT1在肺腺癌组织中的表达情况，分析其表达水平与临床病理特征间的相关性，探讨其临床价值； 2.研究SIRT1在肺腺癌中的生物学作用； 3.探讨SIRT1影响肺腺癌生物学行为的可能的分子机制。 方法： 1.应用免疫组织化学方法检测 SIRT1、Survivin和 VEGF在肺腺癌组织芯片中肺癌组织、相应癌旁组织的表达情况，荧光原位杂交检测ALK，EGFR表达，统计分析SIRT1与肺腺癌临床病理学特征间的相关性，揭示SIRT1潜在的临床应用价值； 2.应用CCK-8法检测SIRT1抑制剂（尼克酰胺、毒黄素）对肺腺癌A549细胞增殖的影响； 3. APC-Annexin V标记法，流式细胞仪检测SIRT1抑制剂（尼克酰胺、毒黄素）对肺腺癌A549细胞凋亡的影响； 4.划痕实验检测SIRT1抑制剂（尼克酰胺、毒黄素）对肺腺癌A549细胞迁移的影响； 5.利用人全基因组寡核苷酸微阵列芯片检测肺腺癌A549细胞及加入SIRT1抑制剂（尼克酰胺、毒黄素）共培养的肺腺癌A549细胞mRNA表达谱； 6.利用生物信息学技术对差异表达基因进行通路分析和功能注释，筛选出在尼克酰胺组和毒黄素组均同向显著表达的差异基因作为SIRT1的下游候选靶基因，并在TCGA数据库验证SIRT1与候选靶基因的相关性； 7.利用RT-PCR和免疫印迹法检测加入尼克酰胺共培养的肺腺癌A549细胞中候选靶基因在mRNA和蛋白水平的表达差异，初步探讨SIRT1影响肺腺癌生物学行为的分子机制。 结果： 1. SIRT1在肺腺癌中的表达及与临床病理特征间的相关性 本研究中，SIRT1在肺腺癌组织中表达显著高于相应癌旁正常组织。SIRT1的表达与病理分期显著相关，但与性别，年龄，TNM分期，ALK和EGFR的表达状态无关。SIRT1的表达与总生存期（OS）相关，是肺腺癌预后不良的预测因子。研究发现SIRT1与VEGF的表达状态显著相关，但与Survivin的表达状态无关。 2. SIRT1在肺腺癌中的生物学作用 研究显示随着毒黄素浓度和作用时间的增加，肺腺癌A549细胞的增殖抑制率及凋亡率明显增加，并呈剂量及时间依赖关系。毒黄素组细胞迁移能力明显弱于对照组，差异有显著统计学意义。 研究显示，尼克酰胺对肺腺癌A549细胞增殖的抑制率呈时间依赖关系，作用24小时时，尼克酰胺对肺腺癌A549细胞增殖的抑制率呈浓度依赖关系。随着尼克酰胺浓度和作用时间的增加，肺腺癌A549细胞凋亡率明显增加，并呈剂量及时间依赖关系。尼克酰胺组细胞迁移能力明显弱于对照组，差异有显著统计学意义。 3. SIRT1影响肺腺癌生物学行为的可能的分子机制 基因芯片mRNA表达谱检测发现，与肺腺癌A549细胞组比较毒黄素组共有745条差异基因表达上调倍值超过2倍，803条差异基因表达下调倍值超过2倍。与肺腺癌A549细胞组比较尼克酰胺组共有2505条差异基因表达上调倍值超过2倍，745条差异基因表达下调倍值超过2倍。 分析同时在毒黄素组和尼克酰胺组显著同向表达的差异基因，发现在两组均表达上调的差异基因共159条，表达下调的差异基因共65条。由于SIRT1在肺腺癌中的生物学作用，进一步分析发现凋亡通路中的 Bcl-2相关转录因子1（BCLAF1）可能是SIRT1下游靶基因。 通过TCGA数据库分析发现SIRT1与BCLAF1均在肺腺癌组织共同表达，并且两者mRNA表达具有相关性。利用RT-PCR技术，发现加入尼克酰胺共培养后，肺腺癌A549细胞的BCLAF1基因mRNA表达水平显著升高。同时，免疫印迹试验显示BCLAF1蛋白水平也显著升高。 结论： 本研究证实SIRT1在肺腺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织，并且是肺腺癌预后不良的预测因子。SIRT1抑制剂可以抑制肺腺癌A549细胞增殖、迁移，促进其凋亡。本研究利用人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片，通过生物信息学技术筛选出差异基因：BCLAF1。并通过RT-PCR和免疫印迹法检测发现SIRT1抑制剂能显著升高肺腺癌A549细胞中BCLAF1基因mRNA和蛋白表达水平。因此，本研究提示 SIRT1可能在肺腺癌的发生发展中扮演促癌基因的角色，其可能通过靶向调控BCLAF1参与肺腺癌的进展过程。这为进一步研究SIRT1的分子机制提供了理论基础和实验依据。
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