摘要
副流感病毒3型（parainfluenza virus type3，PIV3）属于副粘病毒科呼吸道病毒属，是囊膜的单股负链RNA病毒，是引起人和动物呼吸道疾病的重要病原，包括：人副流感病毒3型（Human parainfluenza virus type3，HPIV3）和牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type3，BPIV3）。目前国内外对HPIV3与BPIV3的研究报道较为广泛，但PIV3在羊群中的感染情况在国内外都鲜有报道。本实验室从发病山羊中分离出一株新的PIV3病毒，命名为为山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus3，CPIV3）JS2013。因此为监测该病在羊群中的流行情况，急需建立一种病原学及血清学检测方法，为开展流行病学调查提供依据。 PIV3基因组至少编码6种结构蛋白，即NP、P、M、F、HN和 L蛋白，其中HN蛋白和F蛋白是副流感病毒3型的主要保护性抗原。HN蛋白存在至少6个抗原表位，其N端具有强烈的疏水性，从而使HN蛋白能够牢固地嵌入病毒囊膜的双层质膜内，3个中和性抗原表位均存在于其中。因此本研究利用大肠杆菌原核表达系统，成功表达PIV3 JS2013重组蛋白His-HN，并制备出针对CPIV3 HN的单克隆抗体，以期为副流感病毒3型诊断方法的建立和HN蛋白的结构和功能的研究奠定基础。主要研究内容包括： 1、CPIV3 JS2013 HN基因片段克隆与表达 参考GenBank中发表的牛副流感病毒3型（BPIV3）内蒙09毒株（NM09）全基因组序列（GenBank登录号: JQ063064），设计一对特异性引物扩增山羊副流感病毒3型（CPIV3）JS2013株HN基因部分序列，将扩增得到的基因进行测序，比对分析其与已报道 HPIV3、BPIV3的序列同源性最高分别为74.3%、79.8%。进化分析表明JS2013株并不属于HPIV3与BPIV3，形成一个独立的分支。将HN基因片段克隆至原核表达载体pET-32a（+），获得原核重组质粒pET-32a-HN。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态菌株中，经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE与 His抗体western blot试验分析表明，重组蛋白His-HN诱导表达成功，并以包涵体形式存在，大小约为46 ku。Western blot试验验证重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备的高免血清能够与重组蛋白反应；病毒接种MDBK细胞后，间接免疫荧光（IFA）试验表明其多克隆抗体与病毒产生特异性荧光反应，表明该重组蛋白具有很好的免疫原性和反应原性。 2、CPIV3 JS2013 HN基因单克隆抗体的制备与鉴定 用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗His-HN蛋白的单克隆抗体。按照常规方法制备SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞进行融合，用间接ELISA筛选阳性克隆，采用有限稀释法进行亚克隆，经过3次亚克隆后筛选出3株能够稳定分泌抗His-HN蛋白的单克隆抗体，将其分别命名为1F8、2D5、4A7。其细胞培养上清和小鼠腹水ELISA效价分别为29、28、28和106、106、105。这三株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的Ig亚型均为IgG2b，轻链类型为κ。Western blot试验验证三株单克隆抗体与His-HN蛋白产生特异性反应；IFA与Dot-ELISA试验表明三株单克隆抗体均能够特异性识别 CPIV3 JS2013株。三株单抗的研制成功为建立敏感性高、特异性强的CPIV3抗原诊断方法打下了基础。
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