摘要
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是植物根际生长促进菌中非常重要的一类生防菌。研究表明，芽孢杆菌生防机制主要包括：竞争、拮抗、诱导抗病性及促进生长等4个方面。目前尚未有关于解淀粉芽孢杆菌大分子蛋白激发子的报道，本研究首次从解淀粉芽孢杆菌 NC6菌株中分离纯化出一种能够诱导烟草产生系统抗病反应的新型蛋白激发子PeBA1，为进一步阐述解淀粉芽孢杆菌诱导抗病性提供一定的理论基础。具体实验内容与结果如下： 1.蛋白激发子的分离纯化及质谱分析 通过硫酸铵沉淀，阴离子柱交换层析，以及活性胶回收等一系列蛋白纯化方法，从解淀粉芽孢杆菌 NC6菌株中获得一种能够诱导烟草叶片产生典型过敏反应的蛋白质激发子。并对该激发子进行质谱分析，获得其氨基酸序列，并命名为 PeBA1（ Protein elicitor from Bacillus amyloliquefaciens1）。 2.构建PeBA1原核表达及纯化系统 克隆PeBA1基因，并将目的基因与原核表达载体E1连接，最后转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)进行原核表达。进一步通过细胞超声破碎，Ni柱亲和层析，超滤除盐浓缩获得高浓度PeBA1重组蛋白。SDS-PAGE检测及诱导烟草叶片过敏性坏死活性测试实验验证原核表达的准确性。 3.PeBA1的理化性质及诱导烟草防御反应 进一步研究 PeBA1重组蛋白的理化性质及诱导烟草防御反应。PeBA1重组蛋白能够在4、25、50、80、100℃水浴中孵育15min后保持良好的稳定性。其所能够引起枯斑三生烟烟草叶片过敏性坏死反应的最低浓度为5μM。PeBA1重组蛋白能够诱导烟草防御早期事件如活性氧爆发（包括过氧化氢、超氧负离子的产生）。同时PeBA1重组蛋白可以诱导产生大量的次生代谢产物，包括大量的酚类物质形成等，其能够增强细胞壁强度，阻止病原菌的侵染。 4.PeBA1诱导烟草产生系统抗病性 通过诱导烟草抗病性测试，我们发现 PeBA1重组蛋白能够诱导烟草产生对灰霉病菌和烟草花叶病毒的抗性。PeBA1重组蛋白处理的烟草叶片接种灰霉菌后，病斑直径明显小于蛋白缓冲液处理组，PeBA1处理的烟草叶片接种TMV后所引起病斑数和病斑大小均少于或小于缓冲液处理，证明 PeBA1重组蛋白能够诱导烟草产生系统抗病性。进一步研究发现，PeBA1重组蛋白处理烟草，能够诱导水杨酸途径相关抗病性基因如PR1a、PR1b和PR5和PAL，以及茉莉酸途径相关部分抗病性基因如 COI1和 PDF1.2的转录上调，同时也能够引起在水杨酸介导的系统获得抗病性和植物根围菌引起的诱导系统抗病性中起重要作用的NPR1的转录上调。
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