摘要
机体氧化应激产生的过量自由基，可直接或间接损伤DNA、蛋白质和脂质，使机体的氧化与抗氧化平衡系统被打破，利用外源性抗氧化活性物质对抗体内过量自由基是医学领域的主要手段。传统的抗氧化活性评价方法，因其各自的技术缺陷，严重制约着抗氧化活性物质的发现。因此，亟需建立一种新的抗氧化活性评价方法。细胞代谢组学是系统生物学的一个分支，因其灵敏度高、选择性好、快速、准确性高、可控性强等多种优点，可发展为一种新的抗氧化活性评价方法。与化学评价方法相比较，基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法以细胞为载体，未脱离生物体本身，更接近于生物体氧化反应过程；与细胞学评价方法相比较，基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法运用细胞代谢组学研究方法，可全面反映细胞内代谢物信息。本研究采用细胞代谢组学研究方法，以 HepG2细胞为研究对象，基于 HPLC-DAD-MS技术平台，通过对细胞代谢物的分析，结合多种模式识别技术，获取与抗氧化活性相关的代谢物靶标，构建基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法，并应用该方法评价锁阳提取物。主要研究内容如下： (1)细胞样品前处理及HPLC分析方法的研究。为最大限度地提取代谢物并取得可靠的分析结果，对细胞样品前处理及HPLC分析方法进行了系统优化。细胞代谢物用﹣20 ℃预冷的60%甲醇淬灭、超声波破碎、60%甲醇提取进样分析。HPLC色谱条件为：流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；色谱柱Agilent ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相为1.93 g/L醋酸铵(pH=4.81)和乙腈；溶剂洗脱梯度为0.5-5%乙腈(0-10 min)、5-95%乙腈(10-60 min)；检测波长为254 nm。 (2)基于细胞代谢组学的氧化应激生物标记物的发现。通过MTT实验选择5 mg/L H2O2作用4 h，100 mg/L VE作用24 h，250 mg/L GSH作用24 h建立氧化应激模型。检测细胞内ROS水平及酶活性验证氧化应激模型。对细胞代谢物进行HPLC分析，从典型的HPLC-DAD谱图中选取28个共有峰进行模式识别分析，借助于OPLS-DA模型的S-plot图及VIP值筛选出11种潜在的氧化应激生物标记物。同时，采用LC-MS联用技术得到潜在生物标记物的精确相对分子质量，通过细胞代谢物与对照品的紫外光谱图、保留时间并结合加标法对色谱峰定性，其中p1、p2、p3及p9分别鉴定为苹果酸、VC、GSH及色氨酸。 (3)基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法的建立。在 OPLS-DA模型基础上，建立了基于细胞代谢组学的抗氧化活性定性评价方法。以VE或GSH的CMAA unit值为标准，定量评价物质的抗氧化活性，建立了基于细胞代谢组学的抗氧化活性定量评价方法。 (4)基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法的应用。根据前期建立的细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法评价锁阳提取物，并运用化学评价方法及细胞学评价方法进行验证。结果显示，建立的基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法是可靠的，且结果与传统的抗氧化活性评价方法的结果一致。多种评价方法结果均显示，锁阳多糖与锁阳黄酮具有一定的抗氧化活性，且锁阳黄酮抗氧化活性较强。
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