摘要
朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）是棉花、蔬菜等经济作物上的重要害螨，其防控主要以化学防治为主。杀螨剂阿维菌素（AVM）杀螨效果突出，具有广谱、高效、低残留和对人畜及环境安全等特点。已有的研究发现朱砂叶螨阿维菌素抗性品系（AbR）中γ-氨基丁酸（GABA）含量显著高于敏感品系（SS）。GABA是脊椎动物和非脊椎动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，生物体内GABA含量的调控是GABA合成与分解共同平衡的结果。参与GABA合成与分解的酶分别是谷氨酸脱羧酶（GAD）与γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）。前期研究表明AbR品系中GABA-T活性显著低于SS品系，而GAD活性无显著差异。本论文在此基础上，重点研究了朱砂叶螨GABA含量与阿维菌素杀螨活性的关系，研究结果如下： 1.利用RT-PCR及PCR技术，克隆获得2条GAD基因和2条GABA-T基因，分别命名为GADTC1、GADTC2、GABA-TTC1和GABA-TTC2，GenBank登录号依次为：JQ942360、JQ798396、JQ942361和JQ942362。序列分析表明所得基因均与二斑叶螨亲缘关系最近。采用实时荧光定量PCR（qPCR）分别检测4条基因在SS品系和AbR品系中的表达情况，结果显示2条GAD基因的表达在SS和AbR品系中无显著差异，而2条GABA-T基因在AbR品系中显著下调。以上结果与已有的酶活测定结果一致，表明朱砂叶螨AbR品系中GABA含量高于SS品系的分子机制是GABA-T基因表达下调。 2.抗癫痫药物氨己烯酸（Vigabatrin）是GABA-T的特异性抑制剂，可以利用Vigabatrin抑制GABA-T活性，提高朱砂叶螨SS品系GABA含量的方法来研究GABA与阿维菌素杀螨活性的关系。GABA-T酶活性测定结果显示在离体条件下，随着Vigabatrin浓度的增大，对GABA-T酶活性的抑制率也相应增大，抑制中浓度 IC50为0.443mM。同时，该浓度的Vigabatrin在活体条件下同样可以抑制GABA-T的活性。 3.高效液相色谱测定结果显示Vigabatrin处理后4h GABA含量显著升高，8h时降低；而AVM处理后4h、8h朱砂叶螨GABA含量均显著高于对照，表明AVM可以刺激朱砂叶螨GABA的释放，且作用时间长于Vigabatrin。用Vigabatrin预处理后4h时再用AVM处理，4h后GABA含量与对照无显著差异，表明螨体内高含量的GABA可以抵消AVM的刺激作用。毒力测定结果显示经Vigabatrin预处理后敏感个体对AVM的耐药性提高4.1倍，进一步说明高含量的GABA可以降低AVM的杀螨效果。 4.通过饲喂GABA-T基因dsRNA的RNAi法提高朱砂叶螨内源GABA含量，进一步研究其与阿维菌素杀螨活性的关系。RNAi结果显示，饲喂GABA-T dsRNA后GABA-T mRNA表达下调33%，GABA含量显著增加，朱砂叶螨爬行速度显著减慢。用阿维菌素LC30、LC50分别处理取食GABA-T-dsRNA的敏感个体，死亡率分别减少12%和18%（与对照相比）。说明通过RNAi的方法提高朱砂叶螨GABA含量后，增加了对AVM的忍耐力。 5.利用喷施GABA溶液的方法外源增加朱砂叶螨GABA含量后，其爬行速度显著降低；再分别用6.25、25和100μM的AVM处理朱砂叶螨，与对照处理相比，喷施过外源GABA的朱砂叶螨在一定的浓度和时间范围内死亡率下降，对AVM的忍耐力显著增加。
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