摘要
细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)为一类含亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，它是肝脏微粒体混合功能的氧化酶，主要包括CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4、3A5等10种亚型。肝脏中不同亚型的CYP450参与大部分内源性和外源性物质的代谢。 传统上CYP450酶的个体差异均指个体间差异，为药物代谢、疗效和毒性出现个体差异的主要原因。个体间差异定义为不同个体间的同一种CYP亚型代谢活性不同，通常可以用于指导精准医学中的个体化用药，已被国内外大量研究。 个体内差异指同一个体的不同CYP亚型表现出不同的代谢活性，与个体间差异相比，个体内差异对个体化用药起着同样重要的作用。然而，现在关于CYP450酶的个体内差异却很少被研究者研究。为了更好的实现个体化用药，研究和了解CYP450酶活性的个体内差异非常必要。 目的： 本研究以105例中国人的正常肝脏组织为试验对象，考察了10种主要的CYP亚型（CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4/5）对特异性底物的相对代谢活性和个体内差异，同时分析了不同CYP亚型相对代谢活性的相关性，探讨了CYP基因多态性对个体内差异的影响。期望能够为临床合理用药提供理论依据。 方法： 1人肝标本收集 收集肝功能正常的肝标本105例，年龄范围20～75岁。肝组织经实验室检查确认无HBV或HCV感染，肝功能正常，并且经后期组织病理学检查证实，属于正常肝脏组织。本试验方案经郑州大学医学伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。 2人肝微粒体制备和蛋白浓度测定 人肝微粒体的制备采用差速离心法，肝微粒体蛋白含量的测定采用Bradford法。 3人肝微粒体中CYP酶活性的测定 CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4/5的底物分别是非那西汀、香豆素、安非他酮、紫杉醇、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑。摸索各孵育体系中的最佳蛋白浓度和孵育时间，并最终分别测定105例正常人肝微粒体中10种CYP亚型的酶动力学参数(Vmax、Km和CLint)。 410种CYP亚型的基因多态性分析 采用DNA提取试剂盒从肝组织中提取基因组DNA。10种CYP亚型中，本试验检测了在中国人群中发生频率大于1％的多态性位点。 5统计方法 采用GraphPad Prism5.0软件计算酶动力学参数。以每个个体每种CYP亚型Km、Vmax和CLint的绝对值除以105例个体该CYP亚型对应参数的中位数，即得每个个体每种CYP亚型的相对代谢活性（Relative Km、Vmax和CLint）。每个个体10种CYP亚型的个体内差异采用个体内变异系数(ICV)表示，即每个个体10种CYP亚型的相对Km、Vmax或CLint的标准偏差除以同一个体10种CYP亚型对应Km、Vmax或CLint的平均值。 使用SPSS17.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)层次聚类分析来计算10种CYP亚型的相关性和相似度。 采用SPSS17.0统计软件分析10种CYP基因多态性对相对代谢活性的高低。具体采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和邦费罗尼检测(Bonferroni test)方法，检验水准α为0.05，P＜0.05认为有统计学意义。 结果： 1肝微粒体蛋白浓度测定 标准曲线回归方程为C=1.5898A-0.0512(R2=0.9939)，105例肝微粒体蛋白浓度中位数（范围）为8.39(1.31～11.66)mg·ml-1。 2肝微粒体中10种CYP亚型对探针代谢活性的方法学 10种CYP亚型的探针底物及人微粒体中的其他杂质均不干扰代谢产物的色谱峰，说明本研究建立的高效液相色谱法专属性较高。代谢产物的日内及日间变异均小于10％，且回收率均在90％～110％之间，精确性和准确性均较高。本研究建立的分析方法符合生物样本的测定要求。 CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4/5孵育体系中的最佳蛋白浓度分别为0.3、0.3、0.5、0.5、0.5、0.5、0.3、0.3、0.2mg·ml-1，最佳孵育时间分别为30、30、60、120、60、90、20、30、5min。 3肝微粒体中10种CYP亚型的个体内差异 3.1肝微粒体中10种CYP亚型活性的个体内差异 105例正常中国人肝微粒体10种CYP亚型的相对代谢活性不同，同一个体的10种CYP亚型对代谢探针药物的相对代谢活性差异较大。105例个体相对Vmax Km和CLint的体内百分变异系数分别为44.03％(16.79％～127.42％)、45.88％(18.31％～140.14％)、52.00％(24.20％～134.81％)。 3.2肝微粒体中10种CYP亚型的相对代谢活性 对相对Vmax、相对Km、相对CLint进行排序，其中CYP3A4、CYP2C19和CYP2D6的相对Vmax位居前三名，CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的相对Km位居前三名，CYP2D6、CYP2B6和CYP3A4的相对CLint位居前三名。 410种CYP亚型的相关性 对正常人肝微粒体10种CYP亚型的酶动力学参数进行Pearson相关分析。发现CYP2C8与CYP2C9在Vmax间的相关性最强(r=0.537，P=3.48E-09)。10种CYP亚型的Km间相关性较低，仅CYP1A2与CYP2C9的Km间存在较强相关性(r=0.475，P=3.04E-07)。10种CYP亚型的CLint间相关性较Vmax低。 510种CYP亚型的聚类分析结果 若将10种CYP亚型的相对Vmax聚成两类，则CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2B6和CYP3A4/5可聚为一类，剩余的聚为另一类。其中CYP2C8和CYP2C9相对Vmax的相关性最强，相似度也最高。 10种CYP亚型的Km聚类分析结果显示CYP1A2、CYP2C9、CYP2B6、CYP2C19、CYP2A6、CYP2C8和CYP2D6可聚为第一类，而CYP2E1和CYP3A4/5聚为第二类。CYP1A2与CYP2C9的相关性最强、相似度最高。 用分层聚类分析的方法对10种CYP亚型的相对CLint进行聚类分析，结果可聚为2类，第一类的成员包括:CYP2C8、CYP2C9、CYP1A2、CYP2B6，第二类的成员包括:CYP2A6、CYP2D6、CYP2C19、CYP2E1和CYP3A4/5。其中CYP2C8和CYP2C9的相对CLint表现出最强的相关性和最高的相似度。 6基因多态性对CYP酶代谢探针药物个体内差异的影响 分析每组例数大于7例的基因型对10种CYP亚型代谢活性个体内差异的影响，发现大部分多态性对CYP亚型代谢活性的个体内差异无影响。仅发现CYP2A6*4，CYP2B6785A＞G和CYP2D6100C＞ T显著影响CYP亚型代谢活性的个体内差异。 结论： 1.10种CYP亚型的代谢活性在同一个体内存在巨大的个体内差异，相对Km、Vmax和CLint的个体内变异系数较大。 2.同一个体的CYP亚型之间存在复杂的相关关系，其中CYP2C9和CYP2C8的相对Vmax和相对CLint的相关性最强，相似度最高，CYP2C9和CYP1A2的相对Km的相关性最强，相似度最高。 3.CYP2A6*4、CYP2B6785A＞G和CYP2D6100C＞T可以影响10种CYP亚型代谢活性的个体内差异。
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