摘要
前列腺癌是一种世界性的常见癌症，严重威胁男性生活健康。微小RNA(microRNAs)异常表达广泛参与肿瘤的发生，miR-340已被报道在不同癌症类型中抑制肿瘤生长。然而，miR-340是否在前列腺癌中发挥重要作用目前尚未见报道。因此本研究的目的是探索miR-340在前列腺癌中的表达模式和其功能。然后验证miR-340是否通过其靶基因HMGN5抑制前列腺癌增殖和侵袭，为前列腺癌提供了新的可能的治疗靶点。 本课题包括以下3部分:第一部分:miR-340在前列腺癌细胞和组织中的表达研究。第二部分:miR-340对前列腺癌细胞生物学行为的影响。第三部分:miR-340靶基因及其肿瘤抑制机制初步研究。 第一部分 miR-340在前列腺癌细胞和组织中的表达研究 方法: 1)收集标本，包括20例前列腺癌癌组织与20例配对的癌旁组织标本。 2)使用RPMI1640培养PC-3、22RV-1、DU-145和LNCaP前列腺癌细胞。RWPE-1正常人前列腺上皮细胞无血清培养基培养。 3)采用RT-PCR检测前列腺癌癌组织与癌旁组织标本中miR-340的表达水平，以及前列腺癌细胞系和正常人前列腺上皮细胞miR-340的表达水平。 结果 1)与癌旁组织相比，前列腺癌组织中miR-340的表达明显下降。 2)与正常人前列腺上皮细胞相比，前列腺癌细胞系miR-340的表达明显下降。 结论: miR-340在前列腺癌组织和癌细胞系表达均显著下调。 第二部分 miR-340对前列腺癌细胞生物学行为的影响 方法: 1)用细胞转染的方法转染miR-340 mimics和anti-miR-340至前列腺癌细胞考察增加或抑制者细胞中miR-340表达对列腺癌细胞增殖和迁移的影响。 2)采用MTT法及克隆形成实验检测miR-340过表达及抑制miR-340表达对前列腺癌细胞增殖的影响。 3)采用TUNEL方法检测miR-340过表达及抑制miR-340表达对前列腺癌细胞凋亡的影响。 4)采用western blot检测miR-340过表达及抑制miR-340表达对前列腺癌细胞凋亡相关蛋白caspase-3表达水平的影响。 5)应用基于Transwell小室的侵袭实验检测miR-340过表达及抑制miR-340表达对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。 结果: 1)miR-340过表达可以抑制前列腺癌细胞增殖，抑制其表达可以诱导前列腺癌细胞增殖。 2)miR-340过表达可以抑制前列腺癌细胞克隆形成，抑制其表达可以增加前列腺癌细胞克隆形成。 3)miR-340过表达可以促进前列腺癌细胞凋亡，沉默miR-340表达可以抑制前列腺癌细胞凋亡。 4)miR-340过表达可以抑制前列腺癌细胞侵袭，沉默miR-340表达可以促进前列腺癌细胞侵袭。 结论: 在前列腺癌细胞中miR-340过表达能够显著抑制前列腺癌细胞增殖、诱导其凋亡、抑制其侵袭能力。 第三部分 miR-340靶基因及其肿瘤抑制机制的初步研究 方法: 1)构建含有野生型和突变型HGMN53'UTR的miR-340结合元件的荧光素酶表达质粒，与miR-340 mimics或anti-miR-340共转染至DU-145细胞考察HMGN5是否是miR-340的直接靶基因。 2)采用荧光定量PCR检测miR-340 mimics或anti-miR-340对HMGN5mRNA表达的影响。 3)采用Western blot检测miR-340 mimics或anti-miR-340对HMGN5蛋白以及Bcl-2，cyclin B1和MMP9蛋白表达的影响。 4)共转染HMGN5和miR-340 mimics考察HMGN5过表达对miR-340mimics诱导的前列腺癌细胞生物学行为的影响。 5)Spearman分析前列腺癌组织中HMGN5 mRNA的表达与miR-340表达水平相关性。 结果: 1) miR-340可直接靶向HMGN5基因。 2) miR-340过表达明显降低前列腺癌细胞HGMN5 mRNA及蛋白的表达。相反，抑制miR-340能明显增加HGMN5 mRNA及蛋白表达。 3)miR-340过度表达明显抑制前列腺癌细胞Bcl-2、cyclin B1和MMP9蛋白的表达。相反，沉默miR-340可增加这些蛋白表达。 4)miR-340过表达抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭的作用可以被HMGN5过表达所逆转。 5)前列腺癌组织中HMGN5 mRNA的表达与miR-340得表达水平呈显著负相关。 结论: 确定HMGN5为前列腺癌细胞miR-340的直接靶基因，miR-340过表达通过负调控HMGN5抑制前列腺癌细胞致肿瘤潜力。我们首次报道了miR-340在前列腺癌中的关键作用以及miR-340和HMGN5的直接关系。因此，本研究不仅提供了前列腺癌的肿瘤发生的分子基础，而且还提示了前列腺癌的潜在治疗靶点。
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