摘要
本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 人参皂苷体外抗炎抗氧化作用的研究 目的: 通过体外实验检测人参皂苷Rh2（GRh2）、人参皂苷Rg1(GRg1)及人参皂苷Rg3(GRg3)对脂多糖(LPS)诱导的外周血单个核细胞(PBMC)形成肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β(IL-1β)及一氧化氮(NO)的表达变化，了解三种人参皂苷的抗炎、抗氧化作用并进行对比，筛选出抗炎抗氧化综合效果作用最强的人参皂苷单体，为后续实验提供理论依据。 材料和方法: 采集健康志愿者静脉血，取PBMC进行分离培养，向96孔板中分别加入3μM的人参皂苷Rh2、Rg1及Rg3进行预处理，培养1h后加入100ng/ml的LPS，诱导PBMC出现炎症反应，24h后吸取细胞上清液，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组中TNF-α、IL-1β及NO的浓度。 结果: LPS处理PBMC后，上清液中TNF-α、IL-1β及NO的浓度较对照组均显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。人参皂苷Rh2、Rg1及Rg3预处理均可降低上清液中TNF-α、IL-1β及NO的表达(P＜0.05)，对上清液中TNF-α的表达，下降趋势为GRg3＞GRg1＞GRh2;对于上清液中IL-1β的表达，下降趋势为GRg3＞ GRh2及 GRg1;而对于上清液中NO的表达，下降趋势为GRg3及GRh2＞GRg1。 结论: 人参皂苷Rh2、Rg1及Rg3预处理均可降低LPS诱导的PBMC中TNF-α、IL-1β及NO的浓度，但人参皂苷Rg3在体外抗炎抗氧化的综合作用强于人参皂苷Rh2、gg1。 第二部分 脂多糖诱导小鼠急性肺损伤自我消退模型的建立及环氧合酶2表达的研究 目的: 研究气管内灌注LPS诱导小鼠急性肺损伤(ALI)的疾病特点及转归过程，了解环氧合酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)在ALI中的表达变化，为后续实验提供理论依据。 材料和方法: 雄性SPF级BALB/c小鼠78只，6～8周，体重16～20g，将动物随机分为以下3组:零点组，对照组和急性肺损伤组。以气管内滴注10μg/S0μl脂多糖建立小鼠ALI模型，对照组小鼠气管内滴注等体积生理盐水。零点组在实验开始时立即处死。对照组及ALI组小鼠在给药刺激6h、12h、1d、2d、4d、7d后分别随机处死。评估各组小鼠肺组织病理情况、湿干重比值及髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)评分。收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid，BALF)进行细胞计数，ELISA检测BALF中TNF-α、IL-1β的表达变化。RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)检测小鼠肺组织COX-2mRNA的表达情况。 结果: 1. 各时间点对照组小鼠肺组织的病理学无明显变化，ALI组小鼠出现肺泡结构破坏、间隔增厚，肺泡腔内炎症细胞浸润，这些现象在12h最明显，之后逐渐减轻;急性肺组织评分在12h达峰值，之后逐渐下降，至7d肺组织基本恢复正常。 2. 各时间点ALI组小鼠肺组织湿/干重比值均较对照组明显升高，其比值在LPS刺激12h达高峰，随后逐渐下降。 3. ALI组MPO活性自LPS诱导6h到1d呈上升趋势，之后呈下降趋势。 4. ALI组小鼠BALF中总细胞数目在1d时达峰值，随后下降。 5. 急性肺损伤组BALF中TNF-α及IL-1β在1d达最高值，之后逐渐下降。 6. ALI组小鼠肺组织COX-2 mRNA的表达自6h到12h呈上升趋势，自12h至7d呈下降趋势。 结论: 气管内滴注LPS可以成功诱导小鼠急性肺损伤模型，ALI组小鼠病理学变化、湿/干重比值及COX-2 mRNA在LPS诱导12h达最高值，肺组织MPO评分、BALF中总细胞数目、TNF-α及IL-1β水平在1d达峰值，之后逐渐下降，在无干预因素时，LPS诱导的小鼠ALI模型可实现自我消退，在LPS刺激第7天基本恢复正常。 第三部分 人参皂苷Rg3对LPS诱导急性肺损伤小鼠的保护作用与机制的研究 目的: 以气管内滴注LPS诱导小鼠ALI模型，并用不同剂量的人参皂苷Rg3(GRg3)进行干预，观察GRg3对急性肺损伤的保护作用，并分析其对炎症及氧化应激中相关基因和蛋白的表达，进一步了解GRg3在急性肺损伤中发挥保护作用的机制。 材料和方法: 雄性SPF级BALB/c小鼠72只随机分为以下6组:对照组、GRg3(30mg/Kg)组、LPS组、LPS+ GRg3(10mg/Kg)组、LPS+GRg3(20mg/Kg)组、LPS+GRg3(30mg/Kg)组。GRg3以尾静脉注射的方式进行给药，连续2天，第2次注射后以气管内滴注LPS建立小鼠ALI模型。 评估各组小鼠肺组织病理情况、湿干重比值及MPO评分。收集BALF进行细胞计数，ELISA检测小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的表达变化。Western-Blot检测小鼠肺组织NF-κB p65、iNOS、COX-2蛋白表达水平。RealTime-PCR检测肺组织iNOS、COX-2 mRNA的表达情况。评估肺组织NF-κB p65DNA结合力的情况。 结果: 1. LPS组小鼠肺组织病理学损伤程度、湿/干重比值及MPO评分较对照组及GRg3组明显升高(P＜0.05)。不同剂量的GRg3预处理均可减轻ALI小鼠肺组织的病理损伤程度，降低肺组织湿/干重比值及MPO评分(P＜0.05)，且呈剂量依赖性。 2. 与对照组及GRg3组相比，LPS组小鼠BALF中总细胞、中性粒细胞及巨噬细胞数目均明显增加(P＜0.05)。不同剂量的GRg3组较LPS组小鼠BALF中总细胞、中性粒细胞及巨噬细胞数目均明显降低，并呈剂量依赖性(P＜0.05)。 3. LPS造模后，小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO表达较对照组及GRg3组明显升高(P＜0.05)。而应用不同剂量的GRg3预处理可降低BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的表达，并呈剂量依赖性(P＜0.05)。 4. 与对照组及GRg3组相比，LPS组小鼠肺组织phospho-NF-κB p65/total NF-κBp65蛋白表达比值、NF-κB p65 DNA结合能力、iNOS、COX-2的蛋白及mRNA水平均明显增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。应用不同剂量的GRg3预处理后，小鼠肺组织phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65蛋白表达比值、NF-κBp65 DNA结合能力、iNOS和COX-2的蛋白及mRNA表达水平均明显下降，并表现为剂量依赖性(P＜0.05)。 结论: 1. 在急性肺损伤中，LPS可能通过引起小鼠肺组织NF-κB p65的磷酸化、COX-2及iNOS的表达增加诱导炎症反应及氧化应激，从而诱发急性肺损伤的形成。 2. GRg3可能通过抑制小鼠肺组织NF-κB p65的磷酸化、COX-2及iNOS的表达发挥抗炎抗氧化作用从而对LPS诱导的急性肺损伤发挥保护作用。
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