摘要
目的： 家族性成人肌阵挛癫痫(Familial adult myoclonic epilepsy，FAME)是一种罕见的常染色体显性遗传病，本病以皮质性手部震颤、肌阵挛及偶尔发作的广泛性或局部性癫痫为主要临床表现，外显率高，病程呈良性进展。自1975年首个以震颤和癫痫发作为突出表现的FAME患病家系被报道以来，迄今，在全世界范围内已相继报道了超过100个类似家系，其中，中国的FAME家系已达10多个。目前尚未有本病在世界范围内的人群发病率统计。另外，FAME尚未被归类于国际抗癫痫联盟确定的癫痫综合征的分类之中。 在临床诊断上，确诊FAME主要依据患者典型的临床表现和电生理检查结果。FAME患者的临床表现主要包括震颤、肌阵挛和癫痫。根据对已报道家系的统计，多数患者以皮质性震颤为首发症状，多表现为手指和手部精细样颤动，起病年龄从11～50岁不等，但绝大多数于成年后发病。家系内和家系间震颤的严重程度不等。肌阵挛多表现为上肢肌阵挛抽搐，具体发生时间难以确定，多与皮质性震颤同时发生。16％的FAME患者可以癫痫为首发症状，初次癫痫发作年龄从12～67岁不等，并且82％的癫痫发作呈全面性强直—阵挛性癫痫发作即癫痫大发作，癫痫发作频率不等。劳累、睡眠剥夺、情绪应激等均可促发作。FAME患者中其他临床症状还包括智力衰退，轻度认知功能障碍等，少数患病家系可合并夜盲症、偏头疼或共济失调。经电生理检查主要包括肌电图(EMG)、躯体感觉诱发电位(SEP)和脑电图(EEG)，FAME患者检查结果可显示出广泛分布的皮质兴奋性增高，而证实震颤的皮质来源是本病最重要的诊断标准。体表肌电图可以记录到由肌阵挛引起的肌电暴发，患者经电刺激后可见巨大皮质反应和长潜伏期C反射。癫痫发作期脑电图可记录到异常波全面发放。在临床治疗上，多种抗癫痫药对震颤、肌阵挛和癫痫发作都有很好的效果，患者预后良好，长期生存率不受影响。 FAME不仅临床表现度变异较大，还具有显著的遗传异质性。基于对不同地域和种族的FAME患病家系的研究，本病被分为四型，即FAME1(MIM601068)、FAME2(MIM607876)、FAME3(MIM613608)和FAME4(MIM615127)，四型的连锁定位区域不同，分别被相应地定位于8q24、2q11.2、5p15.31-p15.1及3q26.32-q28这四个不同区带。目前除在2个意大利FAME2家系内鉴定出首个FAME候选致病基因ADRA2B(MIM104260)外，其他三型还没有发现任何明确的致病基因。 在基于家系研究的连锁分析方法的基础上，利用序列靶向捕获技术捕获并富集目标区域DNA再进行下一代测序技术，结合生物信息学分析挖掘变异位点所具有的强大优势，可以快速有效地发现潜在的致病性基因变异，为揭示FAME的致病机制奠定基础，并可在一定程度上为这一特殊痫性疾病提供诊断和治疗等方面的支持。 方法： 一、实验材料 在本研究中，我们共收集了16例明确临床诊断为FAME的患者。所有FAME患者中，男性患者11例，女性患者5例。其中包括3个家系即家系1、家系2、家系3，共9名患者，另收集家系内，正常人共计5人。其他7名患者均具有明确家族史但只收集到先证者生物学样本即患者4～10。所有患者及家系成员的外周血及相关病历资料均由北京协和医院神经内科提供。本研究由中国医学科学院北京协和医院及基础医学研究所伦理委员会批准，所有受试者均自愿参加并签署了知情同意书。 二、实验方法 （一）家系调查及样本收集 1.对患者进行体格检查，了解患者临床表型的详细情况，并绘制出家系系谱图; 2.与患者及其家属签订“知情同意书”; 3.用碘氟消毒皮肤后，抽取外周血5ml，并用EDTA抗凝管收集，于-80℃保存备用。 （二）外周血基因组DNA提取及定量 使用QIAamp DNA Blood Midi Kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)试剂盒从外周血中提取基因组DNA。用NanoDrop2000对提取的基因组DNA进行定量。 （三）致病性基因突变筛查 1、应用微阵列比较基因组杂交(array CGH)技术和实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测基因组拷贝数变异 选取两名FAME患者即家系1先证者(Ⅲ-7)和患者4进行全基因组拷贝数变异分析。所用芯片为安捷伦公司的AgilentTM SurePrint G3 Human CGHMicroarray1×1M芯片，该芯片包含963，029个寡核苷酸探针，探针间距为2.1kb，能覆盖全基因组并对FAME已知连锁区域实行高密度覆盖，可在全基因组水平上检测DNA拷贝数变异。Array-CGH实验部分由上海复旦大学生命科学学院张锋教授课题组完成。对于检测结果，使用实时荧光定量PCR进行验证。 2、基于Illumina测序平台和Ion Torrent测序平台分别对癫痫和震颤相关基因进行高通量测序 (1)基于Illumina MiseqTM检测癫痫相关基因 对5名FAME患者进行癫痫相关基因高通量测序。测序及分析流程如下: ①订制癫痫相关基因杂交探针(癫痫Panel) ②NimbleGen SeqCap EZ Exome Library文库制备 ③模板制备与富集 ④Illumina MiseqTM上机测序 ⑤数据分析 ⑥Sanger测序验证 ⑦基因变异致病性分析 (2)应用Ion Torrent PGMTM检测震颤相关基因 选取3名FAME患者进行震颤相关基因高通量测序。测序及分析流程如下: ①订制震颤相关基因引物库(ALS Panel); ②Ion Ampliseq文库制备; ③模板制备与富集; ④Ion Torrent PGMTM上机测序; ⑤数据分析; ⑥Sanger测序验证; ⑦基因变异致病性分析。 3、应用全外显子组测序(WES)技术检测基因组编码区致病性基因变异 选取FAME家系1内两名患者和一名正常配偶(Ⅲ-9、Ⅳ-2;Ⅲ-8、)、家系2内先证者(Ⅲ-1)、家系3内四名患者和一名未受累成员(Ⅱ-5;Ⅱ-7、Ⅲ-1、Ⅲ-4)进行全外显子组测序，经标准分析、滤过及注释流程后，根据患者表型筛选在患者中出现且家系内正常人中不出现的编码区杂合变异，用一代测序技术进行验证。 结果： 一、2个患者微阵列比较基因组杂交分析结果 Array-CGH检测出2名FAME患者均携带基因组片段拷贝数的改变。其中，家系1先证者(Ⅲ-7)携带chr6:7914932-7922051和chr21:15977347-15988276微缺失，实时荧光定量PCR验证并结合缺失区域及上下游基因功能排除检测到的这两个拷贝数变异;患者4在基因组ehr2:25209118-25225542出现片段缺失，在chr4:39909985-40293500为微重复，实时荧光定量PCR验证后均排除。值得说明的是，这四个拷贝数异常区域都不在FAME已知连锁区域内。 二、癫痫Panel和震颤Panel高通量测序筛选结果 利用本实验室现有癫痫Panel和震颤Panel，分别对5名和3名FAME患者进行了高通量测序，结果如下: （一）癫痫Panel筛选结果: 在家系1分离出1个错义突变:DPYD c.2771A＞G p.V924A;在患者4筛选出4个基因变异;患者5筛选出6个基因变异;患者6筛选出8个基因变异;患者7筛选出12个基因变异。 （二）震颤Panel筛选结果: 在患者5筛选出LRRK2基因1个错义突变;患者8筛选出OPTN基因1个错义突变;患者9筛选出GRN基因1个错义突变。 三、全外显子组测序结果和筛选分析结果 在家系1筛选出家系内共分离基因变异18个;家系2筛选出共分离基因变异20个;家系3筛选出共分离基因变异4个。但无法明确这些突变与家系FAME表型之间的相关性。 结论： （一）应用微阵列比较基因组杂交(array-CGH)技术在2名FAME患者中检测到缺失突变3个，重复突变1个，但经实时荧光定量PCR验证及对变异区域上下游基因的分析排除了上述四个拷贝数变异的致病可能性。结合其他研究者对不同FAME家系的研究结果，推测拷贝数变异可能并不是FAME的遗传学致病机制。 （二）虽然震颤和癫痫是FAME的主要临床表现，但鉴于目前FAME尚未被纳入国际抗癫痫联盟的癫痫综合征分类且具有很高的遗传异质性，已知癫痫或震颤基因不是本研究中FAME患者的致病原因。但是，利用癫痫和震颤Panel进行突变筛查可能对FAME患者的诊断和靶向药物治疗提供线索。 （三）全外显子组测序技术能够快速高效、特异地对外显子组进行测序，但该技术同时具有如无法检测非编码区突变、结构变异等限制。因此，对于FAME的分子遗传学机制研究应基于大家系联合应用多种遗传学检测技术。
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