摘要
少突胶质细胞（Oligodendrocyte，OL）是中枢神经系统（Central nervous system,CNS）的髓鞘形成细胞，对于髓鞘的形成以及神经信息的传递有着非常重要的作用。少突胶质细胞由少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte precursor cell，OPC）分化而来。长期研究明确地表明，OL发育异常、脱髓鞘或髓鞘再生障碍参与了CNS多种疾病的形成，其中包括多发性硬化症（Multiple sclerosis，MS），视神经炎，肌萎缩侧索硬化，精神分裂症，抑郁症等精神疾病的病理生理过程。有最新研究显示内向整流钾离子通道4.1（Inwardly rectifying Kchannel4.1，Kir4.1）在MS病人的病灶区表达异常，Kir4.1通道广泛分布在各种组织，因为该通道电压与电流的关系具有内向整流特性而得名。Kir4.1通道对调节神经的兴奋性、电解质的平衡和维持正常神经功能具有极为重要的作用，但其是否参与髓鞘化异常或者脱髓鞘疾病仍不清楚。少突胶质细胞由少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte precursor cell，OPC）分化而来。目前关于Kir4.1在OL发育以及髓鞘形成中的作用还未见报道。 目前我们的研究旨在Kir4.1是否参与CNS髓鞘发育。我们的实验数据显示，Kir4.1在体外培养的OPC和OL中均有表达，在诱导OPC分化为OL后，Kir4.1表达水平显著增高。加入Kir4.1特异性阻断剂地西帕明（Desipramine，DES)发现细胞中髓鞘相关蛋白（Myelin basic protein，MBP）信号明显减弱，MBP阳性细胞数明显低于对照，证实阻断Kir4.1功能会导致体外OPC分化受阻。同时，在少突胶质细胞系特异敲除Kir4.1通道的小鼠中发现胼胝体和视神经髓鞘发育异常，胼胝体OL细胞减少，海马组织和皮层组织MBP表达量降低。这说明在少突胶质细胞系中敲除Kir4.1会导致OL发育受阻和CNS髓鞘缺陷。这些结果提示向整流钾通道Kir4.1在OL发育及髓鞘形成中发挥重要作用。 目的： 明确内向整流钾通道Kir4.1是否在少突胶质细胞发育及髓鞘形成中发挥作用。 方法： 1.利用Western blot和细胞免疫组化检测OPC分化的不同阶段，Kir4.1及髓鞘相关蛋白MBP的表达情况。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参，聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）方法检测Kir4.1及MBP的mRNA表达。 2.利用Kir4.1的特异性阻断剂desipramine在OPC分化的不同阶段阻断Kir4.1通道96h后，Western Blot检测髓鞘相关蛋白MBP的表达情况。细胞免疫染色方法检测加入DES后，MBP、少突胶质细胞系的标记蛋白Olig2（Oligodendrocyte transcription factor2）、增殖细胞相关核抗原Ki67和血小板源性生长因子α受体（α-receptor for platelet-derived growth factor，PDGFRα）的表达情况。 3.利用Kir4.1f/f小鼠与少突胶质细胞系特异性表达Olig1的Cre小鼠杂交，构建在少突胶质细胞系中特异敲除Kir4.1通道的遗传修饰小鼠品系Olig1-Cre。利用依来铬氰R染色法和电镜技术检测视神经髓鞘的形态学变化，利用Confocal显微镜观察Kir4.1敲除对OL细胞发育的影响。利用Western blot技术检测Kir4.1敲除小鼠海马、大脑皮层以及脊髓中MBP的表达状况。 结果： 1.在体外培养的OL细胞中Kir4.1通道蛋白和信使核糖核酸(Messenger RNA,mRNA)的表达量较OPC增加，OL细胞中MBP蛋白和mRNA的表达量较OPC也明显增加。 2.体外培养的OPC细胞中加入DES后，MBP表达量明显下降，Ki67和PDGFRα表达量明显增加。 3.依来铬氰R染色和电镜观察显示Kir4.1敲除的小鼠视神经髓鞘发育异常，免疫荧光染色显示Kir4.1敲除的小鼠中Olig2、成熟少突胶质细胞标记物(adenomatous polyposis coli(APC)tumor suppressor protein,CC-1)表达量下降。Western blot显示Kir4.1敲除小鼠海马和大脑皮层中MBP表达量明显下降，脊髓中MBP表达量无明显变化。 结论： 1.内向整流钾通道Kir4.1在少突胶质细胞发育过程中发挥重要作用； 2.阻断内向整流钾通道Kir4.1会抑制少突胶质前体细胞的分化； 3.内向整流钾通道Kir4.1的功能异常会影响中枢神经系统的髓鞘形成。
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