摘要
烟草叶面化学成分与烟株抗性和烟叶品质密切相关。为调控烟草叶面化学的含量和组分，本文克隆了烟草西柏三烯一醇合成酶基因（Cembratrien-ol Synthetase，CYC），分别构建了组成型植物过表达载体（pK7WG2-CYC）和腺毛特异表达载体（pCAMBIA1391-CYP-CYC）。采用Ti质粒介导法转化烟草，经PCR、Southern-blot、qPCR、Northern-blot检测，获得了CYC基因组成型过表达和腺毛特异过表达烟草转基因株系，并对转基因因株系进行了形态学、叶面化学成分分析。为阐明CYC基因过表达对烟草叶面成分及烟株抗性和品质的影响奠定了基础。主要研究结果如下： 1.CYC基因克隆及分析：根据NCBI中烟草序列设计引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，获得烟草Nicotiana tabacum K326中的西柏三烯一醇合成的关键基因CYC的ORF序列。序列比对发现，所获得的核苷酸序列与林烟草中的西柏三烯一醇合成酶mRNA的序列同源性高达99%。2.CYC转化烟草研究。CYC基因在烟草中组成型表达：构建了植物表达载体pK7WG2-CYC；采用农杆菌介导方法转化烟草K326，获得了转基因阳性植株68株。对转基因植株进行PCR鉴定，结果显示CYC基因成功整合至烟草基因组DNA。qPCR结果表明，68个再生植株中共有51个表达量高于对照野生型K326。其中，CYC的表达量最高可达对照的40倍以上。 3.CYC基因在烟草腺毛特异过表达：将CYC基因亚克隆至腺毛特异表达载体pCAMBIA1391-CYP中，构建了CYC的腺毛特异表达载体pCAMBIA1391-CYP-CYC。DNA的PCR结果显示7株再生植株中CYC基因都成功插入烟草基因组DNA，取六株进行Southern-blot检测，结果显示，共有四株检测到CYC基因序列成功插入基因组DNA，其中三株插入位点可能是一样的。qPCR结果证明，6个再生植株中，共有5个表达量高于对照野生型K326。6个再生植株除株系9外的CYC基因的表达量明显高于未转基因的对照植株，最高达到74.8倍。Northern-blot检测结果显示，6个再生株系株系5、6、7、8、9、10均出现目的条带，表明CYC基因在转基因植株中实现了转录。 4.转基因植株分析：对CYC组成型转基因植株和CYC腺毛特异过表达转基因植株进行了形态学分析。大部分组成型转基因株系与对照无明显差异，部分株系表型变化很大，出现了茎秆弯曲、植株矮小等现象。CYC腺毛特异表达转基因株系的表型无明显变化。采用GC/MS对转基因植株叶面化学成分进行分析，结果发现叶面分泌物中西柏三烯一醇含量在转基因株系C-14、C-20、C-38、C-53中均明显高于对照，其中，株系C-20最高，可达对照的五倍左右，而株系C-7和C-40中西柏三烯一醇含量低于对照；叶面分泌物中西柏三烯二醇含量在转基因株系C-14，C-53和C-38中均明显高于对照，其中，C-14接近对照的三倍。表明CYC的过表达有利于提高烟草叶面分泌物中西柏三烯一醇、西柏三烯二醇的含量，而对糖酯类和烷烃类化合物的积累无明显影响。
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